01、文献分享

       数字PCR检测血浆高特异/高敏感性DNA甲基化标志物早期筛查结直肠癌

　　背景

　　结直肠癌早发现/早诊断可以大大降低患者死亡率。随着液态活检技术的迅速发展，癌症的早诊成为可能。液态活检的核心是找到高特异性/高敏感性疾病生物标志物(biomarker)，通过检测/监控标志物的变化判断疾病发展进程。在这里，首先利用甲基化芯片进行结直肠癌DNA甲基化标志物筛选，然后利用数字PCR在血浆样本中进行标志物鉴定，最后确定了个三个高特异性/高敏感性结直肠癌DNA甲基化标志物。

　　实验方法

　　实验分两个阶段：第一阶段利用450K甲基化芯片数据筛选结直肠癌特异性DNA甲基化标志物(样本包括结直肠癌，非甲基化外周血白细胞，正常对照，其他癌种)。候选甲基化位置用sanger测序验证并筛选。最后，利用甲基化特异性数字PCR鉴定临床样本，筛选出了三个结直肠癌高度特异的甲基化biomarker，分别是C9orf50，KCNQ5和CLIP4。

　　实验结果

　　1. 临床样本分析C9orf50，KCNQ5和CLIP甲基化与结直肠癌相关性。

　　2. C9orf50，KCNQ5和CLIP4甲基化与临床分期的关系。

　　3.TriMeth甲基化在结直肠癌中的灵敏性/特异性分析。

　　结果小结：

　　候选生物标志物的DNA甲基化通过亚硫酸氢盐测序和结直肠癌肿瘤组织和外周血白细胞的甲基化特异性数字PCR验证，鉴定出三种DNA甲基化标记，C9orf50、KCNQ5和CLIP4，它们都能区分结直肠癌患者和健康个体的血浆(曲线下区域为0.86、0.91和0.88)。在3个甲基化biomarker试验中，两个独立血浆组的特异度为99%(176/178)时，平均灵敏度为85%(218/256)(I期:80% (33/41)，II期:85% (121/143)，III期:89% (49/55)，IV期:88% (15/17))。

　　结论

　　C9orf50、KCNQ5和CLIP4基因甲基化水平在保证高度灵敏性和特异性的基础上，可以通过数字PCR在血浆样本中早期筛查结直肠癌。

       02、数字PCR甲基化检测意义分析

　　DNA异常甲基化是肿瘤液态活检的重要诊断标志物。精准的诊断需要保证：

　　1)选择与癌症特异性/灵敏性高的肿瘤标志物;

　　2)选择适合液态活检的检测技术。

　　Septin9，SDC2，RAFF1A等作为甲基化检测的重要标志物，通过荧光定量PCR检测，已经应用于临床辅助诊断。如下表是目前应用于临床甲基化检测的项目。

　　荧光定量PCR技术在检测肺泡灌洗液和粪便样本时，检测癌症的灵敏性较高，但是肺泡灌洗样本是有创取样，病人一般难以接受，粪便样本一般不好操作。血浆样本是无创检测的最佳选择，荧光定量PCR技术进行血浆DNA甲基化检测的灵敏度较低。而数字PCR高灵敏性和准确性可以进行血浆样本甲基化检测，一方面，是无创检测;另一方面，可以提高检测的灵敏性和准确性。

　　大量的研究表明，与荧光定量PCR相比，数字PCR(dPCR)在检测血浆DNA甲基化时，具有更高的灵敏性和特异性。荧光定量PCR对于检测ctDNA甲基化，其灵敏度较低，有部分漏检情况。为了提高ctDNA甲基化检测率，我们建议采用高灵敏的数字PCR进行血浆ctDNA甲基化检测。

      03、数字PCR甲基化检测解决方案

　　Clarity数字PCR介绍

　　数字PCR技术是一种单分子扩增技术。主要的优势包括：1)无需绘制标曲线，可以直接实现绝对定量;2)是目前基因检测方法中灵敏度最高的检测方法，更适合核酸含量较低的样本检测;3)较荧光定量PCR，结果更准确，更稳定;4)抑制因素对数字PCR扩增几乎没有影响，所以适合复杂样本的检测。

　　Clarity芯片式数字PCR采用毛细管虹吸原理，保证DNA分子均匀分布至每根毛细管，实现DNA的单分子扩增，极大地促进DNA分子的扩增效率，保证了实验结果的稳定性和准确性。

　　检测流程

　　数字PCR检测包括：1)ctDNA核酸提取;2)重亚硫酸氢盐处理;3)配置15ul数字PCR反应液(与qPCR反应体系基本一致);4)反应液分区至芯片中;5)PCR扩增;6)荧光信号检测，仪器判读核酸拷贝数(转化为甲基化率)

　　数字PCR反应液配

　　数字PCR反应液配置前需要进行样本的简单稀释，保证检测浓度在仪器检测范围内(与qPCR一样cDNA或gDNA稀释后进行扩增，一般ctDNA不用稀释)，数字PCR检范围：DNA拷贝数0-33600copies/15ul。

　　数字PCR扩增和检测

　　数字PCR扩增程序与qPCR相同，最关键的退火温度，可根据引物和探针的Tm进行设置优化。

　　数字PCR信号检测，仪器判读出的结果即核酸拷贝数(可转化为甲基化率)，无需标准曲线绘制既可快速完成核酸绝对绝对定量。

　　总之，数字PCR在检测血浆DNA甲基化时，具有更高的灵敏性和特异性。

　　参考文献：Novel DNA methylation biomarkers show high sensitivity and specificity for bloodbased detection of colorectal cancer—a clinical biomarker discovery and validation study.