此篇文献中主要揭示直接qPCR是检测U937细胞培养中支原体污染的一种敏感方法。支原体结构简单，大小介于病毒和细菌之间，是细胞污染物中最常见的一种，细胞主要由支原体阳性细胞系、实验室人员交叉污染以及污染的细胞培养试剂等途径被支原体污染，被污染的细胞会产生一系列生物学变化。在培养过程中细胞很容易被感染，支原体对细胞的抗生素表现出不敏感性且无法直接过滤消除，因此需要对细胞培养成分和支原体感染情况进行监测。本实验中主要是直接检测U937细胞培养物中的支原体污染。操作如下：

　　1. 将感染支原体的U937细胞在RPMI 1640培养基(含10%灭活的FBS和50μg/ml 庆大霉素)中置于37℃培养(含5%的CO2)。

　　2. 取终浓度为0.5 μg/ml(含Bio-Rad、Hercules、CA、USA)的消除剂加到RPMI 1640培养基中培养7天。在培养过程中进行qPCR检测支原体DNA。

　　3. 优化直接qPCR的退火/延伸温度和时间以及样本量。

　　4. 通过直接qPCR检测纯化DNA和上清液，根据Ct值判断直接qPCR的检测效果。

　　结果：

　　图1

　　图2

　　1、由图1-a温度筛选结果得到50-52℃ Ct值最低，因此选取52℃进一步研究;由图1-b减少退火/延伸时间对Ct值的影响可知20 s和60 s 的Ct值差别不大，因此选取最短时间20 s作为退火/延伸时间;由图1-c知样本添加量6 μl和10 μl的Ct值相似，因此选取样本量为6 μl。

　　2、由于DNA纯化后用100 μl洗脱液定容，当纯化DNA样本量为6 μl时等比例上清液为0.36 μl，由图1-d知qPCR检测可知上清液的Ct值明显大于纯化DNA的Ct值，而上清液为6 μl时的Ct值相当于纯化DNA 60 μl的Ct值，说明直接qPCR的灵敏度更高，因此可选取直接qPCR进行支原体消除情况的监测。

　　3. 根据未处理和消除剂处理Ct值(图2-a)的比较可知消除剂对qPCR的性能无影响;排除影响后对加入消除剂的上清进行直接qPCR检测支原体含量，由图2-b可知加入消除剂24h后支原体含量迅速下降，到第四天只有2.3%，第六天几乎检测不到(数据未显示)，说明直接qPCR可以监测治疗过程中支原体的体DNA下降的情况。

　　结论：

　　1. 直接qPCR相对于常规PCR法可以省去DNA纯化和凝胶电泳操作。

　　2. 直接qPCR退火/延伸温度为52℃，时间优化为20 s，总qPCR时间缩短为65 min。

　　4. 直接qPCR检测支原体用6 μl上清液相当于常规PCR检测60 μl纯化DNA的量，直接qPCR的检测灵敏度更高。

　　3. 直接qPCR可以检测支原体基因组浓度的下降情况。

　　支原体检测方法和特点

　　目前市面上主要的检测方法是培养法和qPCR法。

　　培养法检测支原体：

　　1)检测周期长，不适合快速放行检测;

　　2)不适合大样本检测。

　　3)只适合活性支原体检测，有假阴性的可能性。

　　qPCR检测支原体：

　　1) qPCR相对培养法的检测周期短，适合大样本检测。

　　2) 利用qPCR检测支原体，主要是检测细胞培养液中的支原体，在不需要核酸抽提的情况下，直接取5ul左右培养液检测，但是，qPCR直接检测培养液，可能会由于PCR抑制剂的存在导致检测结果不准。

　　ClarityTM数字PCR(Digital PCR，dPCR)是继qPCR之后的第三代PCR技术，可以弥补qPCR存在的一些不足。ClarityTM数字PCR系统提供了一个全新的核酸绝对定量的方法，独特的高密度芯片设计提高了检测的灵敏度;ClarityTM软件可以准确的识别芯片上扩增后的阴性和阳性分区，直接输出数据和图片。

　　ClarityTM数字PCR原理：一种基于单个模板分子PCR扩增的核酸样品定量分析技术，根据阳性反应和阴性反应数目，利用泊松分布来计算目标分子的数目。

　　原理示意图：

　　数字PCR技术是目前灵敏度最高的检测方法，全自动化上样，操作流程简单快速。基于直接qPCR在支原体污染检测中的应用，若将数字PCR技术应用到支原体污染的检测中会有以下几点的优势：

　　1. 直接qPCR检测时需要6 μl样本量，而高灵敏数字PCR对样本用量更低，并且数字PCR抗抑制剂能力强，结果更稳定/准确。检测灵敏度比直接qPCR高100倍左右。

　　2. 直接qPCR检测是相对定量，数字PCR无需标准曲线，便可实现绝对定量。

　　3. 数字PCR是单分子扩增，可以精确检测不同种类的支原体污染情况。

　　4. 直接qPCR检测无法排除细胞培养物是否有抑制作用，数字PCR不受抑制因素影响，结果更加准确、稳定。

　　6. 数字PCR技术在细胞治疗产品中能有效的检测支原体的单分子水平，软件自动生成DNA拷贝数和信号分布图。

　　7. 数字PCR的通量高，4 h可完成96个样本的检测。

　　因此：数字PCR技术在生物制剂质控和放行环节更加适合支原体污染的检测，值得推广。