Twist Bioscience作为一家美国DNA合成产品公司，开发了首个硅基DNA编写平台，为用户提供合成基因、寡核苷酸池等产品，同时提供高通量的DNA合成服务，应用于医药、农业、工业化学品等不同领域。利用硅基DNA编写技术，可一次可平行合成近100万条不同的按照设计的寡核苷酸序列，错误率为1/2300，最长可达300kb且可精准控制氨基酸占比，加快了高质量合成生物学和基因编辑组学工具的生产，降低成本且加速了研究开发进程。

　　其中Twist精准多样性突变库包括单点突变库，散点突变库，多点连续组合突变和多结构域连续组合突变。

　　目前Twist DNA突变库可用于酶工程领域，抗体优化和发现，CRISPR高通量靶点筛选和细胞治疗的CAR改造中，以达到加速研究开发进程的目的。

　　其精准多样性散点突变库在酶工程应用中，与Manfred T. Reetz 教授合作发表了一篇在ChemBioChem的关于传统基因合成和Twist方法比较，具体阐述了Twist方法在基因合成上的诸多优势。

　　题目

　　Beating Bias in the Directed Evolution of Proteins: Combining High-Fidelity on-Chip Solid-Phase Gene Synthesis with Efficient Gene Assembly for Combinatorial Library Construction

　　出处

　　DOI:10.1002/cbic.201700540

　　作者

　　Manfred T. Reetz 教授

　　背景

　　由于基于PCR的传统突变库会导致氨基酸偏倚，显着降低了文库的多样性，可能会遗漏优良的突变体，且不能在蛋白质水平上表现所有的变体，文库的质量远非最佳。本文阐述了相比于传统建库方法，在硅基芯片上应用高保真固相化学基因合成，然后进行有效的基因组装，来进行柠檬烯环氧化物水解酶改造。

　　传统方法：

　　A)通过使用带有野生型LEH基因的质粒pET 22b作为模板。加入一对混合引物进行PCR反应。B)回收含有突变的扩增的短DNA片段，并将其作为引物进行第二次PCR反应。C)进行PCR反应，以带有野生型LEH基因作为模板的质粒pET 22b扩增整个质粒。D)用DpnI酶消除野生型模板并转化为大肠杆菌BL21(DE3)。E)收获最终文库用于测序和活性筛选。

　　Twist方法：

　　A)诱变设计，允许所有变体组合生产。B)高质量，高通量的硅基合成平台，单挑合成任何想要突变的序列。C)确保在DNA水平上特异性引入变体，从而能够快速生产高多样性，全长的基因片段。D)将全长基因片段进行双重限制酶消化并连接至质粒。E)转化为大肠杆菌并收获文库。

　　PCR method

　　Twist method

　　结果

　　1、每个突变库有四个位点，每个位点有四个不同的氨基酸选择，库容为256种，挑取828个单克隆，传统突变有效突变体为144，Twist有249，跟设计相近，占97.3%;非完整序列传统方法139条，Twist65条，约占传统方法的1/2;WT数量：传统11条，Twist4条，约占传统方法的1/3;

　　2、突变体分布比例均匀(Figure4 B)，利于下游筛选

　　3、Twist：17个有益突变 传统：8个有益突变

　　结论

　　Twist方法相比于传统PCR有以下优势：

　　1、突变体数量更多

　　2、不完整的序列更少

　　3、野生型序列更少

　　4、真实多样性远超传统方法，利于下游筛选

　　5、突变体分布比例均匀

　　6、准确度和多样性高