1、幼鼠：相对于成鼠的组织消化来说会简单一些。由于条件限制，我们这里的幼鼠指的是出生后3天内的小鼠。实验过程中共测试了5种幼鼠的组织，获得的单细胞悬液在数量以及活性上都表现较好。

 幼鼠皮肤：胶原蛋白酶I

 幼鼠颅骨、心脏、肌肉（腹部）、肋骨：胶原蛋白酶Ⅱ

 示例：幼鼠皮肤消化后镜检（约53.5万个/ml，活率90.65%）

2、成鼠：消化较为多样化。（以下为成功消化案例）

2.1单一酶消化：

 胶原酶Ⅳ：肝脏、肾脏

 胶原酶Ⅱ：睾丸、结肠、直肠、回肠、十二指肠

 胶原酶Ⅴ：胰腺、肺

2.2组合酶消化：

 皮肤：0.025%胰蛋白酶-EDTA+胶原酶Ⅳ

 胃：胶原酶Ⅰ+胰蛋白酶

2.3研磨法：脾脏、胸腺（将组织直接置于滤膜上研磨，离心重悬获得单细胞悬液）

2.4其他：

 PBMC：淋巴细胞分离液

 骨髓：直接从股骨中获得细胞，过滤膜离心重悬获得单细胞悬液

3、下面以结肠作为例子展示完整操作流程：

【试剂和耗材】

胶原酶Ⅱ型（Sigma/C6885）、DMEM培养基（Coring/ 10-013-CVR）、特级胎牛血清（生工BBI/ E600001-0500）、DPBS（Corning/21-031-CVR）、PBS（无钙镁离子）、15ml/50ml离心管、1.5ml/2ml离心管、70µm滤膜、40µm滤膜、巴氏管、0.4%台盼蓝溶液、一次性细胞计数板【设备及工具】

恒温振荡水浴锅（或芯片杂交箱）、适配15ml/50ml离心管和1.5ml/2ml离心管的低温离心机、镊子、眼球剪、培养皿、生物显微镜

【消化酶配制】

在50ml无菌离心管中称取50mg胶原酶Ⅱ型，加入45ml DMEM培养基和5ml胎牛血清（FBS），混合均匀，分装至15ml离心管中，每个装5ml，共装10管，置于-20°C保存（胶原酶Ⅱ型终浓度为1mg/ml）。需要时取出使用即可。

【运输条件】

取新鲜小鼠结肠置于含10%FBS的DMEM中，冰上短程运输，尽快送至实验室。

【起始量及消化时间】

组织起始量为一只小鼠的结肠，约0.1g-0.2g，消化时间2.5h（若起始量过高或过低，适当延长或降低消化时间），消化期间需取出实时镜检观察情况，若镜检下无明显团块基本消化成单个细胞即可终止。

【操作流程】

  1、对所用工具（镊子、眼球剪等）进行酒精消毒。消化酶、DPBS或PBS（无钙镁离子）、Wash Buffer（含2mM EDTA的DPBS）等放在冰上预冷。

  2、将预冷过的DPBS/PBS倒入培养皿中，将组织取出放入含DPBS/PBS的培养皿中。去除结肠 内容物，漂洗一次。将结肠剪成小段，转移到新的培养皿中进行第二次漂洗，重复一次，总 共漂洗三次。若结肠内容物较多，可增加洗涤次数。

  3、将漂洗好的组织碎块放入2ml离心管 中。将离心管插入冰上，加入少量消化酶（不要在无缓冲液的管中直接剪），将组织剪成更小的碎片。

  4、将组织碎片连同消化酶液一起加入到含消化酶的离心管中，在离心管底部对组织体积进行标记。在强光下观察体积量并进行拍照记录。

  5、将离心管放入恒温振荡水浴锅（或芯片杂交箱，转速调至25），37°C消化一定时间，观察组织消化后剩余体积，并标记及拍照。

  6、过100µm滤膜并用巴氏管对膜上组织进行轻轻搅拌，让剩余的细胞游离出来。

  7、离心收集细胞，300g 4°C离心5min，观察细胞沉淀（可拍照），加入3-5ml DPBS/PBS用巴氏管对细胞轻柔吹打，过一次70µm滤膜。

  8、细胞再用3-5ml DPBS/PBS洗涤一次，视情况可再过一次40µm滤膜，300g 4°C离心5min收集沉淀。

  9、镜检观察有较多小碎片，150g4℃离心5min去除小碎片，收集沉淀。

  10、用预冷的Wash Buffer重悬，稀释至适当浓度，计数并统计活率，立即进行下游单细胞实验。

【注意事项】

  1、结肠消化前需清理干净内容物，剪成适当的小段，多次漂洗干净后再进行后续流程。

  2、300g离心收集细胞时沉淀易悬浮起来，可适当提高离心力，但不要超过500g。