一、出处

Journal of Analytical & Pharmaceutical Research

二、介绍

中国仓鼠卵巢(CHO)细胞是生物制药行业中，首选的宿主表达系统。宿主残余DNA(hrDNA)是一种核酸杂质，需要在生物药物纯化中进行监测以确保纯度和安全性。目前，基于实时定量PCR (qPCR)的方法广泛应用于hrDNA的定量，然而，数字PCR技术具有更高的检测灵敏度和精密度。这里，我们报告了一种数字PCR定量方法，在这个方法中首先用蛋白酶消化蛋白药物，然后将蛋白酶变性处理，利用特异性的引物探针检测CHO细胞DNA残留。在反应中加入数字PCR混合物，数字PCR反应体系被分割入纳米级大小的微反应室，随后进行终点PCR，然后分析荧光并计算出残留DNA的量。与qPCR方法相比，数字PCR方法的敏感性提高了检测精密度和准确度。此外，该方法消除了常规样品检测中DNA提取步骤和DNA的纯度要求。该方法已成功地应用于默克公司研发的几款生物药hrDNA定量。

许多治疗性蛋白，如单克隆抗体药物是在CHO细胞中制造的。蛋白药物中宿主细胞杂质残留带来的安全问题，监管机构已经确定了此类杂质的可接受水平。因为宿主残留DNA(hrDNA)的允许限度是每天10ng剂量，大多数生物药制造商药物的接受标准往往设定为宿主残留DNA低至每毫克研发药物的DNA≤1.0 pg，每天的剂量是未知的。因此，较灵敏的DNA定量的方法，如实时荧光定量PCR(qPCR)，在定量hrDNA时可以不提取DNA。最近，数字PCR已经被不同的供应商作为qPCR的改进技术，用于核酸的绝对定量。数字PCR (dPCR)是一种PCR反应技术混合物被分成数万个微反应单元进行PCR检测，以及没有使用DNA标准曲线的情况下利用泊松分布确定目标浓度，实现核酸绝对定量的技术。

DNA提取会效率影响PCR的灵敏度。我们建立了一种非常敏感的CHO hrDNA dPCR方法，并且不需要DNA提取，只需要利用蛋白酶消化,搭配已经验证的引物和探针，即可实现hrDNA绝对定量。与qPCR相比较，数字PCR具有更低的定量限(LOQ)，在分析范围内具有更高的精密度和准确度。

三、方法

为了进行dPCR，我们准备了一个混合物，每个PCR反应含有12.5µL的2X Supermix RDQ，0.25µL的20X引物和探针，1.25µL的水。每次反应的总初始体积为25µL，以上为15µL超级混合-引物-探针混合物和10µL水作为阴性对照。用5.0µL的CHO DNA和5.0µL的水作为标准DNA样本。用KAPA蛋白酶对样品进行酶解，不是从单克隆抗体样本中提取hrDNA。将KAPA蛋白酶处理过的样本作为PCR模板，进行数字PCR扩增。

四、实验结果

1. 数字PCR定量单抗药物CHO残留DNA。

图1 DS4P+K:单抗药物+蛋白酶K;DS4P:单抗药物;

DS4P+K+NDA：单抗药物+蛋白酶K+背景hrNDA;DS4P+NDA：单抗药物+背景hrNDA 单抗药物没有hrDNA

图2 确定数字PCR检测CHO hrDNA的动态范围和定量线。

五、结论

1. dPCR定量CHO细胞hrDNA具有更低的定量线和准确性;

2. dPCR定量蛋白药物中hrDNA不需要DNA抽提，只需要用蛋白酶K处理抗体药物即可实现精准定量。

参考文献

Digital PCR Method for CHO Host Residual DNA Quantification in Biologic Drugs