文章题目：Single-cell transcriptome analysis of CAR T-cell products reveals subpopulations, stimulation, and exhaustion signatures

　　期刊：《OncoImmunology》，2021年1月，IF=9.2

　　背景介绍：

　　CAR-T产品：由于CAR转染的成功或失败，以及培养环境的差异，使得细胞之间存在极大的异质性，CAR-T产品严格意义上讲是一个复杂的细胞混合物。评估起来较为困难。

　　T细胞耗竭(T Cell Exhaustion)：是指常见慢性感染和癌症患者体内T细胞功能丧失。由于长期暴露于持续性抗原和炎症，精疲力竭的T细胞逐渐失去效应功能，记忆T细胞特征也开始缺失。不过这种耗竭是可以逆转的，至少部分逆转，这主要通过阻止PD-1之类的抑制性通路。

　　CAR-T细胞衰竭：则是指，肿瘤微环境中的CAR-T细胞在持续抗原刺激下会变得反应迟钝，抑制受体越来越多，逐渐失去效应功能。

　　作者的实验思路是讲不同环境和结构下的细胞亚群与健康人细胞进行分析对比，以探究CAR-T产品被刺激后的真实反应区别，以及探索耗竭性CAR-T细胞的转录改变。

　　实验设计：取来自三个健康人个体的PBMC，部分直接培养记为品系A，部分PMBC进行T细胞筛选，然后转染嵌合CAR之后记为品系B，CAR抗原刺激品系B激活后的记为品系C。然后通过ABC一共53191个细胞进行生信分析。

　　这样分组是为了分别代表CAR-T细胞产品的三个关键阶段，即①白细胞样品的分离;②体外产生的CAR-T产品;③特定抗原刺激下的CAR-T产品。

　　实验结果一：

　　由于CAT-T细胞也存在特异的表面抗原RQR8，所以使用流式检测RQR8也可以特异性的检测到CAR-T，再三个供体中，单细胞转录组分析出的CAR-T数量和比例与流式细胞术结果不谋而合，这证明。课题所使用的实验方法上是没有问题且确实可行的。

　　对单细胞结果进行UMAP1分析，所有的细胞被分为一共11个cluster(细胞簇)通过对各个细胞类型的特定基因的表达，可以大致确定每个cluster的功能与类型。以及单个细胞所处的细胞周期。(例如cluster9高表达CD3,GZMB,CCL5,NKG7等基因可以大致确定，Cluster9是NK细胞类型。)

　　我们特别关注Cluster1，由于这个细胞簇高表达CCR7，IL2RA(CD25)等与T细胞活化相关的基因，却低表达SELL(L选择素的基因，功能是使为活化淋巴细胞得以进入淋巴组织，在淋巴细胞中少表达)所以很可能是在免疫应答过程中实际发挥作用的簇。

　　结果二：

　　将三个供体的CAR-T产品细胞拿出来分析，可以看到三个供体的CAR-T细胞产品均分布在11个簇这证明：①个体与个体之间的CAR-T产品是存在较大差异的，各细胞亚型的比例在不同的个体之间比例差别较大。②通过单细胞转录组分析出来的结果，均在11各簇内，是可以相互一起进行分析的。

　　结果三：

　　从细胞处理角度出发，以是否转染进CAR，是否以特定的抗原激活作为两个条件将所有的CAR-T产品分为四组进行分析。可以看到不论是否存在CAR特异抗原激活的情况下，转染了CAR的实验组均高于同等刺激下的未嵌合CAR的组别。且在CAR特定抗原刺激后，百分之五十的细胞分布在cluster1中。我们可以得到以下结论：

　　① 在没有特异抗原刺激下，表达CAR的细胞与不表达CAR的细胞转录组成份是类似的。这些结果表明，不仅仅是T细胞，所有主要的细胞亚型对CAR病毒转导同样敏感

　　② 通过对比特地抗原转录表达后的CAR细胞，对比其他组别的细胞可以发现，在CAR表达的细胞中，有7%的细胞，在遇到特异抗原刺激之前就已经被激活。

　　③ 在簇与簇之间进行比较，Cluster1和Cluster 6中CAR非表达细胞相对增加，同时Cluster中细胞数量相对减少。由于针对CAR的抗原刺激仅能刺激CAR表达的细胞，不会作用到CAR非表达的细胞中，所以这样的结果表明，在CAR-T细胞受到CAR抗原刺激之后，CAR表达细胞和非CAR表达细胞之间存在细胞间的信号传递而受到影响。一部分CAR表达细胞在抗原特异性刺激下获得了类似的转录状态，这些细胞同时从大多数其他簇(除了Cluster 6)转移到Cluster 1。

　　结果四：

　　再将重点放到Cluster1，将其单独拿出来做分析

　　在Cluster1中做UMPA分析发现细胞内有CD8阳性和CD4阳性细胞之间的分离，但是在Cluster1中， 并没有发现CAR表达的细胞与不表达的细胞之间存在明显区别，且与细胞CAR表达的强度也没有关系。

　　这个结果证明了，在CAR-T产品中，虽然存在部分CAR表达细胞在刺激之前就已经有了转录激活，也存在部分CAR表达细胞对CAR特异性刺激不产生响应。但是仍然存在近50%的CAR表达细胞以一致对CAR抗原特异性刺激，进行了激活反应。

　　结果五：耗竭性T细胞

　　通过一系列耗竭性细胞的特征基因(LAG3，PD1,TIM3等)，分别从单细胞转录组及流式细胞术的方式，筛选出来状态可以定义为耗竭性的T细胞一共153个，占抗原暴露的CAR-T表达细胞(Cluster1)总数的7%(2104个细胞中，有153个耗竭细胞)

　　值得注意的是：

　　① 这153个耗竭性细胞在同一细胞簇内与未耗竭的CAR表达细胞相比，耗竭细胞CAR的表达水平要更高。

　　② 从供体角度来看，耗竭细胞主要来源于供体3(占60%)。

　　这些结果说明，CAR-T产品在转染嵌CAR的过程结束之后，单品系的CAT-T耗竭细胞比例就已经被确定了。这个比例与提供PBMC的供体和转染过程有极大关系。但是耗竭细胞的比例在整个CAR-T产品中所占的比例不大平均在7%。

　　总结：

　　① CAR-T产品的差异性非常大，从供体体征和制备过程每一个过程对其细胞簇的组份都会产生影响。

　　② 在CAR特异抗原激活过程中，CAR表达细胞存在特异性的应答模式，有50%以上的CAR-T细胞会被刺激激活，其产生转录反应的途径与T细胞应答类似。

　　③ 细胞耗竭可能与转染CAR以及供体自身特征存在关系，比例占整个总CAR细胞的7%

　　④ CAR-T产品的复杂程度远超之前的认知。细胞质控环节目前没有定式，单细胞转录组及流式分析的方式提供了一个较为全面的方法来评估CAR-T细胞产品的临床相关亚型。

　　文章亮点：

　　①实验分组以及供体来源分组的实验设计思路对CAR-T产品三个关键节点的评估是本文最大亮点。

　　第一次使用单细胞转录组全面的对CAR-T产品进行了多方位评估。

　　文章小瑕疵：

　　在确定耗竭性T细胞的时候，由于单个供体的处理方式定然不同，所以如果能在单个供体的PBMC中采用不同的转染策略或转染时长便可以确定耗竭T细胞的来源于供体关系更大，还是处理方式的关系更大。可以用来指导实际生产中转染过程的范式确定。

　　国内用户的结合点：

　　包括研究者在内都非常赞同这句“我们还是远远低估了CAR-T治疗产品的复杂程度”不仅仅是使用单细胞后，细胞异质性和产品批次间差异才被暴露出来。我们的ISO及单细胞产品目前看是市场上比较好的辅助CAR-T企业做质控和放行的方案之一。