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　　北京大学生命科学学院张泽民教授新的研究成果揭示了肝细胞癌患者(HCC)的免疫细胞特征以及动力学景观，继2017年之后又一篇高分文章于10月份在Cell杂志上发表!本研究结合两种单细胞RNA分离技术，从HCC患者的五个免疫相关位点获得了CD45+免疫细胞转录组信息，揭示了肝细胞癌CD45+细胞类型的动态特性，为肝细胞癌的免疫景观增添了新的维度。

　　研究的背景以及意义:

　　肝癌是死亡率全球排名第三的癌症，肝细胞癌(HCC)约占肝癌的90%。尽管免疫疗法在临床上对于癌症具有益处，但是肝癌的应答率相对于其他癌症要低得多。由于免疫组织参数与治疗效果相关，所以明确肿瘤浸润性免疫细胞的组成和性质对于描述基线HCC免疫环境非常重要。前期研究了HCC患者的T细胞特征，但全景免疫景观是未知的。本研究首次对肝癌、癌旁肝、肝淋巴结、腹水和血液中免疫细胞的组成、功能状态、发育轨迹和细胞间相互作用进行了系统的观察和比较，以研究HCC中免疫细胞的特征以及动态。

　　研究方法:

　　新鲜的肿瘤、邻近的肝组织和淋巴结样本在含10%胎牛血清的 RPMI-1640 培养基(Invitrogen)中切割成约1mm3小块，用MACS tumordissociation kit (MiltenyiBiotec) 酶解30 min。用70 mm细胞过滤器(BD)过滤后，悬浮细胞以400 g离心5min，去上清液后，沉淀的细胞悬浮在红细胞裂解缓冲液(Solarbio)中，在冰上孵育2 min以裂解红细胞，用PBS(Invitrogen)清洗两次后，将细胞团块重悬在分选缓冲液(补充2% FBS的PBS)中。

　　使用HISTOPAQUE-1077 (Sigma-Aldrich) 溶液分离外周血单核细胞(PBMC)和腹水。

　　研究成果：

　　通过全长和3’scRNA-Seq的整合分析肝癌的高分辨率免疫景观

　　为了研究肝癌中的免疫细胞特征，研究者应用scRNA-seq方法研究了16例未经治疗的肝癌患者肿瘤和4个免疫相关部位(邻近肝脏、肝脏LNs、血液和红细胞)的CD45+细胞。对于DSN09患者，应用10X基因组学和SMART-seq 2两种方法，基于聚类来分析该患者的细胞，10X数据确定了20个聚类，SMART-seq2数据确定了22个聚类，并使用Harmony算法整合了这两种类型的数据集，在组合的数据集上，总共识别出37个集群，并对两种方法的数据在捕获率、免疫相关基因种类、基因数上进行了比较分析，发现 SMART-seq2 整合到广泛使用的10X scRNA-seq 研究中，对于以更高分辨率鉴定免疫细胞类型具有协同效应。

　　于是，研究者整合了所有患者的数据，包括 10X 产生的 66187 个细胞和SMART-seq2 产生的 11134 个细胞，并进行了进一步的分析。聚类分析揭示了 HCC 中的主要免疫细胞类型，包括 T细胞、NK细胞、髓系细胞、B细胞、血浆B细胞和ILCs细胞。接下来通过每个细胞簇中观察到的细胞数量与预期细胞数量的比值 (Ro/e)，对组织富集进行定量。总之，通过10X 和 SMART-seq2 数据的联合分析，确定了 HCC 不同组织中具有不同分布模式的多种免疫细胞群。

　　腹水中的淋巴细胞和髓样细胞似乎有不同的来源

　　接下来，研究者在腹水中免疫细胞从其他组织积聚的前提下，通过与其他组织中细胞的表达比对(see STAR 方法)来研究腹水中细胞的潜在来源。观察到淋巴细胞明显类似于来自血液的细胞，而髓样细胞主要映射到肿瘤细胞。通过逆向分析确定肿瘤中的哪些细胞类型倾向于在腹水中聚集，MФ-c1-THBS1在腹水中表现出最高程度的蓄积，而 MФ-C2-APOE倾向于在肿瘤中持续存在。接下来研究了腹水和其他组织中巨噬细胞的关系，基于线粒体突变的系统进化树显示肿瘤和腹水中有许多巨噬细胞共享的谱系。上述证据表明，腹水中特定亚群的淋巴细胞和巨噬细胞可能起源于肿瘤。

　　肿瘤富集巨噬细胞的两种不同状态

　　数据集中发现的6个巨噬细胞簇中，MФ-c1-THBS1 和 MФ-c2-C1QA 在肿瘤组织中富集。MФ-c1-THBS1中富含髓细胞衍生抑制细胞 (MDSCs) 的标记基因上调，而MФ-c2-C1QA 中的基因类似于 TAMs 和 M1 及 M2 巨噬细胞的标记基因。且MФ-c1-THBS1(MDSC 样巨噬细胞)和 MФ-c2-C1QA(TAM 样巨噬细胞)形成了一个连续的但具有明显表达特征的结构，具体来说，MDSC 样细胞高表达 S100A 家族基因，而它们表达低水平的 HLA 相关基因，相反，TAM 样细胞表达一组以前在肺癌 TAMs 中发现的基因。进一步对HCC患者的肿瘤切片进行多色免疫组化染色，在不同的细胞中检测到S100A8 和 SLC40A1 的相互排斥的信号，说明在HCC患者中存在两种不同的巨噬细胞状态。

　　LAMP3+DCs是一种肿瘤中具有潜在迁移能力的成熟树突细胞

　　DC在癌症免疫中的主要功能是获得肿瘤抗原，迁移至LNs，并激活新生T细胞响应。研究者重点研究了肿瘤中富集的三个DC亚群：DC-c1-CD1C、DC-c3-CLEC9A和DC-c4-LAMP3。DC-c4-LAMP3与已知标记物体内的任何经典DC子集不一致，DC-c4-LAMP3中的细胞表达成熟标志LAMP3、CD80和CD83;迁移标志CCR7;淋巴细胞再循环趋化因子CCL19和CCL21。为了验证这个群体在体内的存在，研究者对另外5个HCC患者样本进行FACS，比较数据集中肿瘤浸润DCs的转录组和乳腺肿瘤浸润DCs亚群的转录组数据，发现所有这些DC亚群都可以包含LAMP3+DCs，因此LAMP3+DCs似乎存在于多种肿瘤类型中，并且可以被scRNA-seq检测到。

　　接下来，研究者体外刺激前后对树突状细胞进行了scRNA-seq，以表征树突状细胞亚群在树突状细胞形成过程中的转录变化。DC被分为10个细胞群，且LAMP3+DCs在LPS+IFNγ和poly I:C处理的样本中比未处理的样本组成更大的群体, 证实成熟刺激诱导LAMP3+DC，LAMP3表达是多种DC亚群的成熟标志。并对肝癌树突状细胞亚群进行RNA速度分析，发现LAMP3+树突状细胞可能起源于cDC1和cDC2，且刺激后的 RNA 速度分析显示，过渡阶段的细胞(C07和C09)对LAMP3+树突状细胞表现出强烈的定向流动。另外，研究者使用Spearman相关分析比较了体外和HCC中的整体转录组，体外生成的LAMP3+树突状细胞和HCC树突状细胞表现出最高的相关系数共同的基因表达。

　　接下来，研究者使用来源于小鼠组织迁移cDCs的标记基因检测了HCC的DC迁移潜能，与cDC1和cDC2相比，LAMP3+DC表现出最高的“迁移评分”。通过分析线粒体突变追踪不同组织中LAMP3+DC的谱系起源，确定了在LNs和肿瘤中具有共同谱系的少量细胞，比在其他组织之间更丰富。并通过RNA速率分析观察到 cDC1和cDC2在肿瘤和淋巴结之间没有明显的定向流动。相反，在LAMP3+树突状细胞内，肿瘤来源的细胞表现出向淋巴结定向流动的趋势，显著高于cDC1和cDC2，总之，肝癌中的LAMP3+树突状细胞具有成熟的特征。且这些树突状细胞可能起源于cDC1和cDC2，并表现出向淋巴结的迁移能力。

　　树突状细胞与淋巴细胞的相互作用关系

　　为了研究骨髓细胞和淋巴细胞之间的相互作用，研究者使用了一组免疫相关配体-受体(L-R)对以深入了解细胞簇之间的调控关系。共预测97个L-R对，介导淋巴细胞与Tex细胞，CD4-c5-CXCL13，Treg细胞以及增殖性T细胞的相互作用。在三个DC亚群中，LAMP3+DCs表现出最高的配体数量，并且具有T细胞亚群的LAMP3+DCs的L-R数量高于cDC1和cDC2。数据表明，在肝癌中，LAMP3+树突状细胞可以通过多种L-R对调节多个T细胞亚群，包括PD-1/PD-L1，并且更可能与T细胞的功能障碍相关。

　　结论：

　　本研究对来自不同组织部位的免疫细胞的全面表征揭示了在癌症背景中免疫细胞的动态特性，通过一系列分析揭示了TME、LNs和腹水中髓系和淋巴细胞的分化谱系和迁移关系，并开发了网络工具用于分析和可视化一个或多个用户输入基因的单细胞数据。这份数据可以作为进一步研究的宝贵资源，以获取更深入的生物学见解，从而为当前的肝癌免疫疗法带来新的治疗靶点和反应的生物标志物

　　参考文献：

　　Azizi, E., Carr, A.J., Plitas, G.,Cornish, A.E., Konopacki, C., Prabhakaran, S.,Nainys, J., Wu, K., Kiseliovas,V., Setty, M., et al. (2018). Single-Cell Map of Diverse Immune Phenotypes inthe Breast Tumor Microenvironment. Cell 174, 1293–1308.e36.