谈起慢性炎症，已经被科学家证实是导致心脏病、脑梗死、糖尿病等慢性疾病的主要原因，是一个慢性的沉默“杀手”!

　　麻省理工学院和哈佛大学广泛研究所及西湖大学生命科学学院的研究者发现：小肠免疫反应中的信号异常可触发涉及多种免疫细胞类型相互作用的慢性 2 型炎症，并利用高通量单细胞转录组测序技术对58067个小肠免疫细胞进行了分析。

　　研究的背景以及意义:

　　小肠中的免疫系统是由先天和适应性成分组成的复杂网络，免疫反应失调通常会导致慢性炎症反应。2型炎症的一些标志，包括免疫球蛋白E(IgE)抗体和2型细胞因子的产生，如白介素-13(IL-13)和IL-5，依赖于跨不同细胞类型的紧密调节和协调免疫反应，如辅助性T细胞2(Th2)细胞、肥大细胞和组2固有淋巴细胞(ILC2s)。尤其是，ILC2已成为组织稳态和2型炎症的关键调节因子，但目前对参与2型炎症的细胞，维持内环境稳定的机制，以及除了免疫细胞以外的其他可能参与小肠细胞环路的细胞类型仍知之甚少。本研究将scRNA-seq与生理和遗传扰动相结合，解析2型肠道炎症的细胞环路。

　　研究方法:

　　在体视显微镜下使用细剪刀小心地从小肠中分离派伊尔结(PPs)，组织用新鲜制备的消化缓冲液消化(RPMI-1640含有100μg /mL Liberase TM 和 50 μg/mL DNase I)，37℃消解之后用70um过滤器过滤，然后进行FACS染色。

　　固有层细胞分离 (LP)，切下LP段小肠之后在含10 mM EDTA 的预热(37℃)PBS溶液中在37℃下孵育15 min，然后在冰上孵育15min。之后剧烈震摇组织。用含2% FCS 的PBS洗涤两次后，组织在预热的℃消化缓冲液中在旋转混合器中消化25 min。然后将上清液通过70um过滤器，并进行FACS染色。

　　研究成果：

　　小鼠小肠的稳态和2型炎症状态的免疫图谱

　　为了全面描述小肠中的免疫细胞，研究者分别从稳态以及诱导卵清蛋白(OVA)的2型炎症反应后的小肠LP和PP区域收集58067个免疫细胞，利用scRNA-seq进行分析。研究者在两个区域中注释了27个细胞亚群，跨越T细胞、B细胞、ILC、树突状细胞(DC)、髓细胞和基质细胞，频率在0.07%到14%之间。并使用scvis对scRNA序列数据进行建模和可视化，揭示了在稳态下LP区和PP区细胞组成的预期差异，LTi细胞在PP区和LP区显著富集，ILC1s和NK细胞也在PP区显著富集，表明它们在PPs中具有独特的功能。

　　ILC2比例的增加及其表达程序的改变是OVA引起的2型炎症的突出特征

　　研究者对炎症(OVA)和稳态(PBS)状态下的细胞组成进行了比较，发现在OVA给药小鼠中观察到肥大细胞扩增，ILC2频率增加，且巨噬细胞和中性粒细胞频率也显著增加。揭示了2型炎症对细胞固有表达变化的影响在LP和PP区域的肥大细胞和ILC2中最为显著。

　　利用主题模型确定肥大细胞，ILC2s，Th2细胞和成纤维细胞亚群中炎症增加的特定细胞类型程序

　　为了确定2型炎症反应中表达程序的更多细微差别变化，研究者使用潜在的Dirichlet分配进行主题建模，分别研究了每个细胞谱系或细胞群的主题模型，恢复了细胞类型特定的程序。发现用OVA处理后，肥大细胞活化程序在肥大细胞中的权重显著高于对照组;ILC2 激活程序在ILC2簇的权重在炎症诱导后显著更显著;在炎症状态下，与炎症反应相关的基因程序在Th2细胞中的权重更大，而与T调节细胞相关的基因程序在炎症和内环境稳定状态下保持不变，表明2型炎症的激活可能没有明显干扰调节性T细胞的活性。另外，IL-33+PDPN+肠道成纤维细胞的数量显著增加，表明基质细胞衍生的IL-33可能在促进肠道2型炎症中发挥关键作用。

　　Calca基因编码的α-CGRP是炎症诱导的ILC2激活程序的关键特征，但其受体受到炎症的抑制

　　在ILC2激活程序中，Calca是评分最高和最独特的基因，ILC2s中Calca转录量高于数据集中的其他细胞类型，且只有在胃内注射OVA后才能检测到编码外显子5的α-CGRP。相反，CGRP受体组分的相应转录物在稳定状态下在ILC2s中表达，但明显被肠道2型炎症抑制。

　　为了确定α-CGRP是否能直接触发ILC2s中的信号传导，并在炎症条件下影响其转录状态，研究者对从小肠分离的KLRG1+ILC2s在体外用IL-25单独刺激或者与α-CGRP共同刺激之后进行了大量RNA序列分析，检测到关键有丝分裂基因的表达，证实了IL-5和IL-13在蛋白质水平上的诱导作用，揭示α-CGRP共处理显著抑制IL-25诱导的细胞分裂。

　　α-CGRP抑制2型炎症诱导的ILC2s在体内的活化和扩张

　　接下来，研究者使用IL-25诱导的活体激活模型来显示α-CGRP抑制炎症反应中ILC2s的表达。发现腹腔注射α-CGRP对野生型小鼠IL-25诱导的KLRG1+ILC2s的扩张有损害，此外，α-CGRP还显著抑制食物过敏模型中睾丸内ILC2s的扩张

　　接下来，研究者测量了肠KLRG1+ILC2s刺激后的表达谱，基因表达分析表明，α-CGRP激活了cAMP反应模块，α-CGRP单独刺激诱导ILC2s细胞内cAMP蓄积。α-CGRP刺激在细胞内内负向调节ILC2增殖，这种作用可能是通过在cAMP反应模块中诱导参与细胞周期阻滞的基因介导的。总之，α-CGRP介导的信号有助于维持肠道KLRG1+ILC2s和2型免疫的动态平衡。

　　结论：

　　本研究借助单细胞转录组测序，构建了小鼠小肠稳态以及OVA诱导下的免疫细胞图谱，经过分析揭示了在IL-25诱导的急性炎症和OVA诱导的过敏性炎症模型中，α-CGRRP在抑制肠道ILC2s扩张中的作用。这对于监测治疗患者中过敏性疾病的发生率将是非常重要的，为理解肠道免疫系统在每种特定细胞类型中对2型炎症的应答提供了资源。

　　参考文献：

　　Biton,M.,Haber,A.L.,Rogel,N.,Burgin, G.,Beyaz,S.,Schnell,A.,Ashenberg,O., Su, C.W., Smillie, C., Shekhar, K., et al. (2018). T helper cell cytokines modulateintestinal stem cell renewal and differentiation. Cell 175, 1307–1320.e1322.