Salk生物研究所基因表达实验室与北京大学第三医院妇产科北京生殖内分泌与辅助生殖技术重点实验室等研究单位合作建立了一套3D分化系统，该系统能够通过谱系分离和自身组织生成囊胚样结构(EPS-类胚)，并提出可以通过细胞重编程从成年细胞中产生EPS胚泡的概念证明，为通过使用培养的细胞创造可行的合成胚胎铺平了道路。研究成果于2019年9月发表于Cell杂志上。

　　研究的背景以及意义:

　　哺乳动物的胚胎发生始于受精卵，该卵分裂产生卵裂球。小鼠卵裂球直到8细胞期均被认为是全能的，之后卵裂球压缩、极化，经历前两个谱系分离形成三种不同类型的胚泡细胞。本研究开发了培养条件，能够稳定培养多能干细胞或扩增的潜能干细胞(以下简称为EPS细胞)，使其具有全能性。单细转录组测序技术揭示了EPS囊胚在转录上与自然E3.5囊胚相似，包含三种囊胚细胞系，为研究早期胚胎发育以及用培养的细胞创造胚胎提供了有力的证据以及基础。

　　研究方法:

　　用口吸管人工取出EPS囊胚，在含0.04%BSA的DPBS中洗涤3次。用自制的酶混合物(0.5Xversene(Lonza，17711E)、0.5X Acu max(Innovative Cell Tech，AM105)和0.05X Dnase(STEMCELLTechnologies，07900))在37℃搅拌30分钟，获得约500个胚泡并分离。分离后的细胞用DPBS 0.04%BSA洗涤3次，在同一缓冲液中再悬浮。细胞密度由TC10细胞计数器测定(Bio-Rad，1450001)。用versene同样的方法分离囊胚。

　　研究成果：

　　开发的3D分化系统可使EPS细胞发话为囊胚样结构

　　为了验证EPS细胞可进行细胞分化并通过自我组织形成囊胚样结构这一想法。测试了一种常用的DTSC培养基中EPS细胞的分化情况，发现尽管细胞聚集物在TSC培养基中单独生长良好，但它们未能形成任何球形结构，以1:1比例将胚胎培养基(KSOM)与TSC培养基混合，在少量细胞聚集体中可诱导空腔形成。为了进一步改善分化条件，联合使用fgf4、肝素、BMP4、CHIR99021和A83-01可获得最高的EPS囊胚形成效率，在萌芽期用Rho激酶(ROCK)抑制剂Y-27632处理EPS细胞，以提高细胞存活率。观察到EPS在细胞接种后3天出现分裂。胚胎干细胞继续扩大，在第5天或第6天达到早期囊胚样大小。接下来将低浓度的嘌呤霉素(0.25mg/mL)加入到分化培养基中，逐渐去除肠上皮细胞，可以从单个EPS细胞中产生克隆性的EPS囊胚，表明，单个EPS细胞仍然具有形成整个EPS母细胞的能力。

　　EPS类胚泡的形成概括了早期着床的关键分子，并能分化为三种胚泡谱系

　　接下来，作者研究了早期胚胎着床前发育的关键细胞和分子事件是否会在EPS囊胚形成过程中消失。播种后4小时，发现细胞松散连接。播种后18小时，细胞开始形成紧密聚集，细胞粘附蛋白E-钙粘蛋白和紧密连接蛋白ZO1开始在细胞连接处积累。在卵裂球压缩后，极化开始。在第2天，细胞聚集体的一部分(33%)开始在根尖表面富集PAR复合蛋白PAR6。在第3天，大多数细胞聚集体(75%)向根尖侧呈现PAR6富集的极化模式，并验证了EPS囊胚形成也需要完整的Hippo-YAP信号通路。进一步检测了EPS囊胚形成过程中TE和ICM谱系的分离以及这两个谱系的细胞在聚集体中的空间分布，发现随着早期囊胚的进一步发育，ICM分离为两个谱系：EPI和PE。表明EPS类胚泡的形成概括了早期着床的关键分子，并能分化为三种胚泡谱系。

　　EPS囊胚的转录组分析

　　使用单个EPS 囊胚进行Bulk-RNA测序并进行主成分分析(PCA)，并将其转录组信息与已发表的E3.5早期囊胚和E3.0桑椹胚的数据进行比较，EPS囊胚在PC1和PC2轴上均更接近囊胚。无监督相关聚类也表明，EPS囊胚更靠近囊胚。在体RNA序列水平上，EPS囊胚比桑椹胚更像囊胚。

　　为了深入了解EPS囊胚和囊胚之间的相似性和不同谱系，利用单细胞转录组测序，分析了从EPS囊胚和囊胚中收集的2700多个单细胞的转录本，利用SEURAT进行的综合分析显示，来自EPS囊胚和囊胚的细胞之间有很大的重叠。聚类分析将所有细胞分为七个簇，其中四个簇由EPS囊胚和囊胚共享，根据标记基因的表达模式，研究者确定一个簇为ICM或EPI，一个簇为TE，两个簇为PE。这三个主要来自EPS母细胞的簇显示了ICM、EPI和TE-markers的混合表达，可以代表中间型和/或非承诺型细胞。此外，进行了无监督聚类分析，并从两个样本中确认了类似谱系的聚类。进一步地，为了揭示EPS囊胚和囊胚在各个谱系中的差异，我们对DEGs进行了功能性的注释。在EPI谱系中，鉴定出53个富含与干细胞维持、繁殖和DNA甲基化相关的功能项。在PE谱系中，囊胚和囊胚之间鉴定出67个DEGs，这些DEGs主要与囊泡运输和内吞作用有关。对于TE谱系，两个样品之间只有两个DEGs有显著差异。

　　EPS囊胚的体外以及体内发育潜能

　　首先测试了体外条件是否能支持胚胎着床期后胚胎干细胞的发育，在囊胚的体外培养中，产生了一个卵筒结构，其中胚胎外胚层和EPI作为两个半球被内胚层包围。在IVC培养基中培养EPS囊胚也会形成类似的结构，大约49%的培养囊泡和32%培养的EPS囊胚产生了一个组织化的蛋筒结构，并观察到F-肌动蛋白在EPI样比较中心富集，细胞呈玫瑰花状结构，极性蛋白aPKC排列在形成EPI样腔的细胞中，具有E5.25-E5.5胚胎的特征。

　　对胚泡进行更严格的功能测试是确定胚泡是否能在子宫内发育为胎儿。为此，研究者将性交后2.5天的EPS囊胚移植到假孕小鼠体内，并分析其在活体发育中的潜能，证实了EPS囊胚可以在子宫内植入、触发蜕膜化并继续生长。

　　结论：

　　本研究展示了EPS细胞可以单独分化和自组织产生囊胚样结构，这些结构与自然囊胚具有相似的细胞、分子和功能特征。该方法为研究早期着床前发育提供了一个独特的、高度可塑的卵黄系统，并且经过进一步的优化，有可能在体外利用该系统产生全功能的合成胚胎。

　　参考文献：

　　Beccari, L., Moris, N., Girgin, M., Turner, D.A.,Baillie-Johnson, P., Cossy, A.-C., Lutolf, M.P., Duboule, D., and Arias, A.M.(2018). Multi-axial self-organization properties of mouse embryonic stem cellsinto gastruloids. Nature 562,272–276.