一、出处

2019.frontiers in microbiology

二、摘要

基因治疗病毒载体开发的主要挑战之一是为其大规模生产建立优化的过程，这需要优化上游和下游过程以及能够逐步分析病毒特征的方法。这里最大的问题是过多的病毒载体，其中许多干扰了分析技术。这里我们以腺相关病毒(AAV)为例，展示了使用分子方法和透射电子显微镜对病毒载体进行定量和表征的优势。分析结果表明，就稳定性和分析差异而言，数字PCR(dPCR)比实时荧光定量PCR(qPCR)表现更好，尤其与部分纯化过程相关。此外，我们证明了样本准备前用PCR技术分析的重要性。我们用透射电镜分析评估了病毒的结构、聚集物和杂质的存在，发现这些影响了通过qPCR和dPCR观察到的病毒滴度的差异，并且可以通过样品制备来改变。这些结果可作为建立分析方法的指南，这些分析方法用于提供AAV病毒载体的同一性和纯度的测量。

三、实验结果

在本研究中，我们实施了一种整体方法，并证实了AAV定量和表征的关键点。我们比较了两种平台，并评估了不同样品预处理方案对定量的影响。我们还展示了对病毒载体特性进行透射电镜分析的附加价值。

01、dPCR和qPCR检测预处理AAV样本差异对比

将原始AAV样本进行稀释(10倍差异，高浓度和低浓度)，分别用qPCR和dPCR进行定量检测，根据单个预处理的四个重复的最小和最大值之间基因组数量的倍数差异来评估qPCR和dPCR的可变性，定量PCR为1.4-3.2倍，dPCR为1.1-1.6倍。不同处理间最小和最大值的倍数差异，qPCR为7.7倍，dPCR为2.4倍。

02、确定DNA酶的最低水平

在2units/reaction水平上，观察到载体基因组滴度显著下降，表明存在游离DNA。DNA酶浓度的进一步增加对确定的载体基因组滴度没有任何显著影响，表明实验中使用的DNA酶可能没有非特异性蛋白酶活性。

03、dPCR技术检测下游纯化过程中AAVrh.10mCherry样本优于qPCR技术

dPCR技术检测下游纯化过程中AAVrh.10mCherry样本，无论是DNA酶处理组，DNA酶和蛋白酶K处理组，其CV值均小于qPCR检测技术，说明dPCR检测AAV样本的稳定性高于qPCR技术。

04、预处理后比较qPCR和dPCR检测靶标的差异

在三种不同的预处理后，通过qPCR和dPCR用四种序列靶标(CMV增强子、β肌动蛋白、β珠蛋白、polyA)测定平均载体基因组滴度。

05、dPCR和qPCR检测样本对比CV

分别用dPCR和qPCR对73份和63份样品进行了检测，dPCR中位CV值为5%，qPCR中位CV为13%。

06、透射电镜分析鉴定了病毒聚集体和受损衣壳

在DNA酶处理的样品中，大多数病毒颗粒聚集在一起，这可能是因为透射电镜分析的缓冲液不是最佳的(DNA酶反应缓冲液)或蛋白质含量高。DNA酶处理的样品在病毒滴度和聚集物含量方面具有可比性，与DNA酶浓度无关。由于DNA酶处理，没有观察到对AAV衣壳的独特破坏作用。此外，我们在DNA酶处理的样品中观察到许多蛋白质聚集体或背景。随着DNA酶浓度的增加，蛋白质杂质和聚集物增加，这可能是DNA聚集的结果。

四、结论

1.就稳定性和分析差异而言，dPCR比qPCR更适合去除残留质粒的AAV定量;

2. 透射电镜可作为建立分析方法的指南，用于提供AAV病毒载体的同一性和纯度的测量。

五、参考文献

Accurate Quantification and Characterization of Adeno-Associated Viral Vectors

六、ClarityTM数字PCR介绍

01、介绍

Clarity数字PCR管中芯片技术巧妙地利用了毛细管的虹吸原理实现PCR反应液分区。Clarity芯片由15000根毛细管组成，芯片的独特结构保证了分区的稳定性和重复性。

02、Clarity数字PCR优势

绝对定量：不需要标准曲线实现绝对定量;

高灵敏：检测下线可以达到单拷贝;

可回收：芯片上的样本可回收;

开放：可以qPCR试剂兼容;

高通量：每天完成近200个样本;

无交叉污染：封闭系统防止交叉污染

03、生物制药领域应用案例

RCR/RCL检测;

AAV/疱疹病毒/腺病毒定量;

Hela细胞HPV18 E6/E7检测;

病毒/细菌/支原体污染检测;

宿主(CHO/293/Vero)细胞DNA残留;