目前核酸定量的“金标准”是荧光定量PCR(RT-qPCR)。数字PCR(digital PCR)技术的出现必将撼动荧光定量PCR“金标准”的地位。因数字PCR是一种绝对定量技术，因此在定量的准确性上高于定量PCR，适合大量标准品的标定;另外，数字PCR是一种单分子扩增技术，因此具有更高的检测灵敏度，灵敏度是qPCR的100倍以上，可以解决qPCR“假阴性”的问题;总之，数字PCR优势明显，是核酸定量的发展趋势。

      今天和大家一起了解一下，为什么数字PCR比定量PCR检测结果更准确，并且检测灵敏度更高。在这里和大家分享一篇数字PCR在COVID-19检测中的应用文献，以展示其准确性和灵敏度。

      题目 : 利用数字PCR实现SARS-COV-2高灵敏和准确定量

      出处 : 2021 Talanta

      单位 : 中国计量科学研究院高级计量科学中心

      方法 : 本研究利用数字PCR技术检测SARS-CoV-2开放阅读框1 ab (ORF1ab)、核衣壳蛋白(N)和包膜蛋白(E)基因的方法。为探讨RT-dPCR技术在SARS-CoV-2诊断中的可行性，对103例疑似患者、77例密切接触者和16例假定的恢复期患者共196份临床咽拭子样本进行了RT-dPCR分析。

图1 实验设计图

实验结果

1.数字PCR定量SARS-COV-2线性范围

线性方程，斜率在0.93-1.02之间，R2≥0.9997，平均动态范围104-0之间。

2.确定dPCR的LOB和LOD

对3个空白样本进行60次检测分析，以确定LOB值。E、ORF1ab和N的LOB分别是1.6、1.6和0.8copies/reaction。

为确定ORF1ab的LOD值，对5个样本在3个不同时间点进行76次实验测试，计算出ORF1ab的LOD为2copies/reaction;

为确定N和E的LOD值，E用5个样本检测83次，E用4个样本检测71次，获得E和N的LOD值为2copies/reaction;


3.检测发热患者COVID-19比较dPCR和qPCR

在103份标本中，29份阳性，25份阴性，49份可疑。然而，61份样本(包括19份阴性样本和42份可疑样本)经qPCR证实为阳性，因此总共有90名患者可被报告为SARS-CoV-2核酸阳性并被诊断为新冠肺炎病。据后续报道103例患者均经RT-qPCR再次采样和临床症状检测，确诊为SARS-CoV-2感染。因此，103名患者的SARS-CoV-2检测的真阳性率从28.2%显著提高到87.4%。

此外，61份样本，经qPCR检测无论是阴性还是可疑，但经dPCR检测呈阳性，报告的ORF1ab、N和E的平均病毒载量分别为31、25和26拷贝/反应。29个阳性样品显示出相对高的病毒载量，ORF1ab、N和E的平均病毒载量分别为998、1099和2594拷贝/反应。

从恢复期患者中收集了16份咽拭子(表1)。qPCR报告12例阳性，3例可疑，1例阴性。但这16例患者均经RT-dPCR确诊为阳性，说明仍需住院观察。

分析dPCR和qPCR检测的拷贝数和ct值之间的相关性，结果表明ORF1ab的R2=0.7.78，N的R2=0.7106。

用数字PCR检测单拷贝基因和阴性样本(qPCR检测的结果)，结果发现dPCR检测的范围分别为2-100和2-15copies/reaction。

1.dPCR可以准确检测出qPCR漏检样本;

2.dPCR显著提高了咽拭子标本中SARS-CoV-2诊断的准确性，降低了假阴性率，采样更方便、更简单。

3.dPCR更敏感，适用于来自隔离和观察患者的低病毒载量标本，这些患者可能没有表现出临床症状。

4.dPCR可用于定量监测恢复期患者，以评估疾病进展。

参考文献

Highly accurate and sensitive diagnostic detection of SARS-CoV-2 by digital PCR