文章题目：Single-Cell Analyses Identify Brain Mural Cells Expressing CD19 as Potential Off-Tumor Targets for CAR-T Immunotherapies

　　翻译为：单细胞分析鉴定表达CD19的脑mural细胞为CAR-T免疫疗法的潜在非肿瘤靶标

　　期刊：《Cell》，2020年10月，IF=38.6

　　背景介绍：CD19与CAT-T治疗的关系

　　1.CD19基因

　　CD19基因全称是B淋巴细胞抗原基因CD19，表达穿膜蛋白CD19

　　CD19在B淋巴细胞的发育各期都有表达

　　2.针对CD19的CAR-T治疗有效，但是也存在神经毒副作用

　　对于难治性B细胞淋巴瘤，用针对CD19的CAR-T治疗，有效缓解率达到40-70%

　　同时，受治病例中有39~64%的发生神经毒副作用

　　3.作者推论大脑中有表达较高水平CD19的细胞成为了CAR-T攻击的靶标

　　所以课题设计围绕两个问题开展：

　　①在大脑中是什么细胞表达了CD19，

　　②是否是因为CAR-T针对这种表达CD19的细胞的攻击，引起了神经毒副作用。

　　数据结果分析：

　　结果一：

　　

　　通过分析了2364个由人前额叶皮层来源的单细胞转录组测序数据，将数据做聚类分析。聚类之后的数据，做UMAP图，通过一系列的经典的maker基因的表达将细胞类型进行更加细致的分类。

　　

　　然后作者发现有这样一小部分细胞，同时表达CD19，和Mural细胞的maker基因CD248。且不表达B细胞的Maker基因CD79A。这个结果说明作者的第一个推测是正确的，大脑内是存在表达CD19的细胞的，且这类细胞不表达B细胞的maker基因CD79A，故说明测序数据表示的原细胞既不是B细胞而且不是混合了B细胞的双细胞，而是脑Mural细胞。(Mural细胞翻译过来叫壁细胞，由于与B细胞同音，因此后文都称Mural细胞。)

　　同时观察到这些mural细胞在表达CD19的同事还高表达CD81基因，CD81蛋白是CD19的伴侣蛋白，CD19本身是一个跨细胞膜的蛋白，它需要CD81蛋白的帮助，来完成跨膜过程。这证明这类细胞在CAR-T治疗过程中可能成为CAR-T的靶细胞。

　　结果二：

　　

　　

　　为了评估在人脑Mural细胞中CD19的表达， 作者做了免疫组化，使用的抗体编号是BT51E，抗CD19的C末端。对于跨膜蛋白CD19，其C末端是位于细胞质这一面的，结果发现，在大脑的各个位置都能检测到信号，也就是说在大脑的各个位置都有CD19的表达

　　结果三：

　　

　　后续通过脑转录组数据库中的数据对与CD19基因表达相关性最高的200个基因进行GO分析。发现在大脑中，与CD19高度相关的基因(CD248,CSPG4,ANPEP,FN1等)发现富集的条目是与神经血管单元，血管生长，对流体切变力的响应相关，而与免疫应答相关性较弱。这证明，CD19在成年人大脑中的表达，与Mural细胞的丰富程度有关，而与B细胞的关系不大。

　　结果四：

　　

　　

　　接着，针对鼠源和人源，作者分别涉及了三种CAR-T细胞，然后用A20细胞系(鼠源CD19阳性细胞)进行了CAR-T裂解实验。

　　(moCD1928z：mo代表mouse，CD1928z代表，CAR-T第一段为鼠源CD19，第三段为CD28重组的CAR-T)

　　

　　使用三种CAR-T分别处理特殊的NSG小鼠(特殊品系，特点是小鼠没有B细胞，之所以选择NSG小鼠是因为该研究主要是为了探究针对CD19的CAR-T治疗对B细胞之外的细胞，器官造成的伤害。那么NSG小鼠没有B细胞，所以就可以排除掉CAR-T进攻B细胞所造成的伤害)

　　该图结果为两行，五列，下面一行为上面一行中白色小方框的放大图。该图是经过CAR-T处理后使用红色的EBD染色的结果，EBD染色反应的是血脑屏障的渗透作用强度。(渗透越强颜色越深)

　　第一列使用的是甘露醇，甘露醇是能够让血脑屏障渗漏变高的化合物，做阳性对照。

　　第二列是没有经过CAR-T处理的结果，做阴性对照。

　　可以看到针对第五列中moCD1928z：CAR-T第一段为鼠源CD19，第三段为CD28重组的CAR-T。处理后使血脑屏障的渗透率有大幅度的升高。这便是由于CAR-T细胞进攻Mural细胞造成的直接结果。

　　总结：

　　①大脑的周细胞和内皮细胞中有表达CD19

　　②针对鼠CD19的CAR-T会攻击鼠的大脑，并造成小鼠大脑血脑屏障的渗漏增加。

　　③针对两个特征抗原的，有组合识别功能的CAR-T，也许能避免或减少非特异的CAR-T杀伤。

　　文章的亮点：

　　①做了使用了转录组库的数据对脑和肺等其他器官的CD19基因的GO分析，发现这种CD19在非B细胞的高表达现象只出现在脑中，而肺周细胞不会产生CD19。

　　②除数据库外，另使用了真实样本(健康人死亡脑组织样本)进行了免疫组化，及CAR-T细胞裂解实验。

　　由于文章太长，文献分享只选出了几处关键跟大结论相关的实验结果进行展示，文章研究思路清晰，另外文章还有很多非常旁支及发散的问题都拿出了阴性或阳性结果支撑逻辑，在每一个问题提出的过程中都做了正反假设以及相应的实验数据。

　　感兴趣的朋友可以自行查阅全文：DOI：https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.08.022

　　文章小瑕疵：

　　①仅使用NSG小鼠来评估CAR-T对脑周细胞的杀伤作用，但是未建立免疫系统正常，或B淋巴瘤患病小鼠的疾病模型，进行CAR-T处理，无法充分说明临床的神经毒副作用完全来源于Mural细胞损伤。

　　②拥有脑肺两器官的GO分析数据对比，但是出发点是肺部细胞拥有很多的周细胞，没有拿出额外的耗能组织做阴性对照。而且在实验假设退行中，主要高表达CD19的细胞类型是mural细胞，而不是mural细胞的大类，周细胞(周细胞包含mural细胞及rouget细胞)

　　③小鼠CAR-T治疗实验，CAR-T产品没有设置CD19阴性，CD28阳性的对照。

　　国内用户的结合点：

　　①目前国内多家CAR-T企业研发了一系列的针对多个特征抗原的CAR-T产品“AND”方法(同时要有两种特定抗原的细胞，CAR-T才会启动杀灭功能)或“NOT”方法(拥有目标抗原A抗原，但是没有B目标抗原的细胞，CAR-T才会启动杀灭功能)以此达到精准选取目的细胞的CAR-T治疗方法。这个过程通过单细胞测序技术可以在治疗样本中很快查明机理，指导产品开发，理论上可以规避神经毒副作用，特定器官损伤等风险。

　　②但由于CAR-T研发信息过于保密，且测序的实验难度不大，Microwell-seq技术可以轻松的把握实验推进节奏，且成本较低。用于CAR-T企业建立自己的CAR-T产品库，我司之前与南京某上市CAR-T治疗企业，对接的CAR-T的单细胞业务，对方也是想要找到一个自主选择权限较好，可以搭建自己平台的建库手段。以此找到了良好的切入点。

　　③我们将会与CAR-T企业积极沟通，看能否将成功的经验进行复制。