湖南大学日前发表文献，基于Simoa平台，成功开发出了超灵敏的Fn14检测方法，灵敏度比传统ELISA提高了200-300倍，可以对血清中低浓度的Fn14进行准确可靠的检测，未来可用于Fn14相关疾病的早期检测。

　　背景：

　　Fn14(Fibroblastgrowth factor inducible-14)是一种受体蛋白，在癌症和其他一些疾病的进展中发挥重要作用，研究表明其过表达与肿瘤、自身免疫性疾病、肾脏疾病等相关。免疫组织化学(IHC)法，是一种侵入型的组织活检技术，且不能定量检测蛋白质浓度。液体活检的侵入性要小得多，传统ELISA无法检测到血清中低丰度的Fn14，可能会导致误诊。因此基于Simoa平台，开发出了超灵敏的Fn14检测方法。

　　单位：

　　湖南大学化学生物与纳米医学研究所

　　研究方法：

　　试剂准备：SimoaHomebrew试剂盒，抗体等。

　　流程：捕获抗体包被磁珠，检测抗体生物素化，上机(Simoa HD-1)，优化。

　　图1: Simoa技术检测Fn14示意图

　　结果：

　　为获得更好的Fn14检测性能，从10个抗体(5个单克隆抗体，5个多克隆抗体)组成的44个不同的抗体对组合中，筛选出了2个性能较好的抗体对组合，其中m5+m2的组合在simoa平台表现出的性能较好，因此在m5+m2的组合的基础上进行优化(图2)。相较于多克隆抗体，单克隆抗体的非特异性结合较少，包被到磁珠表面的是单克隆抗体。

　　图2: 2个较好的抗体对组合。m5:捕获抗体;m2和p2：检测抗体。

　　2-step和3-step相比，背景信号差不多，但2-step的信号强度更强，因此选择2-step(图3)。

　　图3: Simoa Fn14检测，2-step和3-step。

　　基于标准曲线，检测的范围为1.26-3683pg/ml，LOD为0.32pg/ml，灵敏度比传统ELISA提高了200-300倍。

　　图4: Simoa Fn14标准曲线，标曲点分别为1，5，10，50，100，500，1000pg/ml。

　　表格1: Simoa与传统ELISA灵敏度和检测范围对比。

　　特异性分析， SimoaFn14检测对其他蛋白(CRP, IL-6, IL-8, p53, FGF2 和FGF21)几乎无信号，说明Simoa Fn14检测对Fn14有很好的特异性。

　　图5: Simoa Fn14特异性分析。Fn14: 100pg/ml;其他蛋白：10ng/ml

　　血清样本测试。利用sample diluent B(Quanterix)对血清样本进行线性稀释(1:2，1:4，1:6，1:8)，显示出很好的线性(图5)。3个血清样本进行回收率实验，回收率在85.4%-120.7%，说明对血清样本有很好的准确性和可靠性(图6)。

　　图5: 人血清样本线性稀释。

　　表格2: 血清样本回收率实验

　　结论：

　　Simoa Fn14检测方法显示出了很高的灵敏度，可以对血清中Fn14进行可靠准确的检测，且Simoa HD-1是全自动分析，未来可用于Fn14相关疾病的早期诊断。

　　参考文献：

　　Yichen Chen, Qiyong Cai, Song Li. A single moleculeassay for ultrasensitive detection of Fn14 in human serum. AnalyticalBiochemistry. 2019.

　　Simoa Homebrew支持自主研发

　　Quanterix 提供客制化试剂盒(HomebrewDevelopment Kit)开发方案，用于客户开发新的生物标志物，或提高已有实验方案的检测灵敏度，不论是对于基础研究还是转化研究都极具价值。

　　Simoa HD-X/HD-1, SR-X,SP-X平台均支持homebrew，对于已购买仪器的用户会提供免费的homebrew试剂盒开发培训。