Cell | 单细胞RNA测序绘制小鼠内皮细胞图谱

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来源:大分子生物 | 作者:Neoline | 发布时间: 2021-05-21 | 1865 次浏览 | 分享到:

内皮细胞(ECs)排列在血管内，是氧气和营养物质输送、免疫细胞运输和排泄物进出远距离组织的重要通道。不同组织中的内皮细胞具有不同的表型，可能是为了满足每个组织的不同生理需求。然而，单个组织中的内皮细胞是否以及在多大程度上在单细胞水平上存在表型差异，以及特定血管中的内皮细胞是否在不同组织中是异质的，在很大程度上尚不清楚。为了探究内皮细胞的异质性，本研究对11只成年小鼠组织中的内皮细胞进行单细胞RNA测序，并提供了完整的数据集供参考。

　　文章题目

　　Single-Cell Transcriptome Atlas of Murine Endothelial Cells

　　影响因子

　　Cell IF=36.216

　　研究背景

　　实验方法

　　实验材料：8周大的雄性C57BL6 / J小鼠，经过4天的隔离程序分别提取不同组织的内皮细胞，利用0.1%胶原酶I和0.1%胶原酶II消化成单细胞悬液，经FACS分选之后上机分离捕获单细胞mRNA。

　　scRNA-seq:10x Genomics

　　生信分析：t-SNE、差异基因表达谱、轨迹分析

　　实验结果

　　绘制细胞图谱探究小鼠内皮细胞的异质性

　　研究者首先对小鼠内皮细胞进行分离和纯化之后，搜集39182个细胞进行了单细胞RNA测序。在对检测到的基因数量和线粒体数进行质量过滤、评估重复项后，将唯一转录本归一化以获得总阅读深度。随后，根据细胞的基因表达谱进行基于图的聚类，并使用t-SNE进行可视化。来自不同组织的内皮细胞表现出显著的转录异质性。淋巴管内皮细胞(LECs)在功能和解剖学上有别于血管内皮细胞(简称“BECs”或“ECs”)。因为这项研究的主要目标是聚焦于BECs，而且因为研究者获得的BECs比LECs多，所以接下来研究者简单描述了LECs，并鉴定了差异表达的标记基因。

　　研究者使用基于秩积的方法来鉴定每个组织的丰富的EC标记基因。对排名前10的标记进行热图分析显示，除了比目鱼肌和趾长伸肌(EDL)骨骼肌外，每个组织的EC都有不同的签名，这些组织表达重叠的标记基因。值得一提的是，其中一些顶级标记基因仅由单个组织的EC表达(Pglyrp1,Lcn2,Tmem100分别在脑、睾丸和肺中)，而另一些EC标记(Fabp4、Aqp7、Nkx2-3)则在两个或两个以上的组织中保守。大多数这些标记是由来自特定组织的内皮细胞的实质部分表达的。来自不止一个组织的内皮细胞表达共同的标记提出了这样一个问题，即这些内皮细胞是否彼此表型相关。

　　EC的组织间异质性

　　为了研究组织间EC的异质性，研究者首先采用层次聚类和多尺度引导重采样相结合的方法。这一分析表明，来自某些组织(睾丸和脑;肝和脾;小肠和结肠;比目鱼骨骼肌和内侧副韧带)的ECs在树状图上聚集在一起，这表明转录组特征部分重叠。为解释内皮细胞的这种组织分组现象，对从分子签名数据库(MSigDB)中选择的615个血管相关基因集的内部生成列表进行了基因集变异分析(GSVA)，对排名前10位的表达基因集的热图分析表明，来自这些组织的内皮细胞高表达的基因集参与了不同的生物过程。

　　进一步为了研究驱动不同EC表型差异的潜在分子机制，研究者使用了单细胞调控网络推理和聚类(SCENIC)。这一分析预测，来自不同组织的内皮细胞上调了不同转录因子网络的表达。如Foxq1和Hoxd9分别在脑内皮细胞和睾丸内皮细胞中表达上调，而Foxf1网络在肺内皮细胞中表达丰富，骨骼肌内皮细胞则表现出较高的Pparg网络活性。在GATA家族成员转录因子的驱动下，肝脏和脾脏内皮细胞富含调节子。通过热图表达分析证实了这些转录因子的转录调控。

　　跨组织的血管床异质性

　　进一步地，研究者通过对每个组织的EC进行基于图形的亚聚类来研究组织内EC的异质性。显示了每个组织特异性EC亚簇的前20个或前50个标记基因的表达、每个组织的唯一分子标识符(UMI)和基因的数量以及每个EC亚簇的相对比例。研究者共在所有组织中确定了78个不同的EC亚群，包括：(1)传统EC表型(动脉，毛细血管，静脉和淋巴EC)，在不同组织中数目可变;(2)组织受限型EC亚群(大脑中的脉络丛;肠中的Madcam+静脉和Aqp7+毛细血管);(3)意外的EC表型，例如脑，脾，肌肉和心脏中的干扰素激活的EC、心脏，肌肉，睾丸和肾脏中的血管生成EC、以及在肝和脾中的增殖EC。

　　研究者评估了跨不同组织的不同血管床(动脉，毛细血管，静脉，淋巴管)中EC的差异/相似性，这些血管床占EC的最大部分。为了捕获EC的异质性，使用了补充方法。首先，研究者探讨了这些血管床中的哪些EC标记在组织之间保守或以组织特异性方式表达。因此，对于每种组织，研究者将簇汇总为以下EC表型：(1)动脉EC(包含大动脉和动脉EC子簇)，(2)毛细管EC(所有毛细管EC子簇)，(3)静脉EC(大静脉和静脉EC子簇)和(4)淋巴EC(所有淋巴EC子簇)。不包括表达两个血管床(毛细血管和毛细血管EC)基因的EC，以及仅限于某些组织的EC。然后，计算出组织中每个合并的EC亚类中排名前50位的标记的中位排名得分。在所有组织中有80%识别出的中位秩<35的标记基因被认为是保守的血管床标记。研究者确定了动脉，静脉和淋巴管的多个保守标记，但检测到的毛细管保守标记较少，突出了整个组织中毛细管EC标记的更大异质性。当分析在所有组织的<25%(对应于一或两个组织)中发现的中位等级<20的组织特异性血管床标志物时，发现毛细血管的组织特异性标志物多于淋巴管组织。这就提出了一个问题，即毛细血管内皮细胞是否更灵活地适应组织微环境以满足组织的特定需求，这与淋巴管在不考虑其组织微环境的情况下排泄渗出液的更普遍的作用相反。

　　其次，为了探索来自同一血管床(动脉、毛细血管、静脉、淋巴管)的跨越不同组织的ECs在转录上是否彼此相似，研究者使用Jaccard相似性分析对来自不同组织的汇集的动脉、毛细血管、静脉和淋巴管ECs的排名前50位的标记基因集的相似性进行评分。该分析表明，动脉EC的转录组签名在各个组织中相对相似，并且与毛细管，静脉或淋巴EC的转录组签名不同。对于毛细血管，静脉和淋巴EC，也获得了类似的发现。

　　组织内分析揭示了特殊的EC表型

　　接下来研究者专注于具有特殊生物学特征的内皮细胞。在肠道中，确定了一部分毛细血管内皮细胞(5.6%–23.2%)的转录水平与甘油和脂肪酸的摄取和代谢有关。在脑中，发现了一小部分(1.4%)脉络丛毛细血管内皮细胞亚群，其特征是已知标记基因Plvap的表达升高，还检测到Esm1的丰富表达，这是脉络丛毛细血管内皮细胞在RNA水平上的已知标记。还检测到健康器官的内皮中未曾预期的EC。例如，在大脑，心脏，肌肉和脾脏中发现了一群表现出干扰素反应的毛细血管EC(1.7%–11.6%)。当关注这5个组织中每一个所表达的前50个标记基因时，检测到8个常见干扰素诱导基因的子集，这引发了一个问题：干扰素信号在这些组织中是否可能在健康的EC稳态中发挥作用。

　　同样出乎意料的是，在心脏、骨骼肌、肾脏和睾丸内皮细胞中发现了一组表达血管生成基因表达特征的毛细血管内皮细胞(2.1%-11.1%)。对它们的前50个标记基因的分析显示，5个组织中有4个组织中有7个基因上调。此外，在肝和脾中，增殖的毛细血管内皮细胞表达典型的增殖标记，分别为1.4%和0.6%，总共有22个基因由这两种EC表型共同表达。并且对EC标志物(CD105或CD31)和这些特殊EC表型的标志物的双重免疫染色证实了scRNA-seq数据的正确性。

　　组织间代谢基因特征的异质性

　　接下来研究者探索了血管床内皮细胞跨组织代谢基因表达信号的异质性。仅关注代谢基因，分层聚类与多尺度引导重采样，揭示了使用非代谢和代谢基因时获得的EC的相似组织分组，这表明代谢转录组特征促成了ECs的组织分组现象。使用EC中所有1180个可检测的代谢基因并对排名前10位的代谢基因转录本的表达水平进行热图分析，观察到来自不同组织的EC上调了比目鱼肌EC和EDL骨骼肌EC除外的不同代谢基因集的表达。聚焦于一条代谢途径中的多个基因，观察到来自大脑以及在较小程度上睾丸的内皮细胞上调了与葡萄糖、氨基酸和脂肪酸转运有关的转运蛋白的表达，这些转运蛋白参与了葡萄糖、氨基酸和脂肪酸的运输。脾脏ECs上调参与胆固醇代谢的基因的表达。此外，肺ECs上调了cAMP介导的基因表达代谢。心脏和肌肉EC以及较小范围的肠道EC表达了参与脂质吸收和代谢的基因的转录水平较高。

　　接下来，研究者评估了EC异质性的另一个水平，即来自单个组织内不同血管床的EC是否上调了不同代谢标志物基因的转录，以及这是否以组织依赖的方式发生。例如，在大脑中，转运蛋白基因在动脉、毛细血管、静脉和干扰素激活的内皮细胞中表达上调，但在脉络丛血管内皮细胞中不表达。肝脏的血管床内皮细胞与所有其他组织不同，这是因为该组织中的每个血管床都上调了一个血管床中不同标志物的表达，而在其他血管床中的表达低得多。在肺中，静脉通过上调特定代谢标志物的表达而与其他血管床区分开来。因此，内皮细胞在单个组织的不同血管床中表现出代谢基因表达的异质性。

　　使用EC Atlas分类法从公开可用的EC数据集中注释EC

　　接下来，研究者探索了EC Atlas分类法在识别其他可公开获得的scRNA-seq数据集中的EC表型方面普遍有用的方法。使用了来自Tabula Muris肝脏，心脏，大脑，肾脏，后肢肌肉和肺部数据集的EC。通过使用scmap和每种EC表型的前10个标记基因，几乎所有EC都可以分配给在EC Atlas分类法中检测到的一种组织特异性EC表型。值得注意的是，没有发现性别差异，显着偏向于不同EC表型的存在EC数据集。当使用scmap将EC Atlas识别的EC表型分配给来自脑，肺和心脏的其他可公开获得的scRNA-seq EC数据集时，获得了相似的结果。