背景

　　宫颈癌是全世界第四大最常见的女性恶性肿瘤。每年，超过50万妇女被诊断出患有宫颈癌，导致30万人死亡。宫颈鳞状细胞癌(Cervical squamous cell carcinoma , SCC)是最常见的组织学亚型，约占所有病例的70%。鳞状细胞癌抗原(SCC-Ag)是宫颈鳞状细胞癌最有用的生物标志物，目前大多数研究是回顾性设计，仅在一个时间点检测到SCC-Ag。迄今为止，很少有人对手术到辅助治疗期间血清SCC-Ag水平的动态变化进行研究。在本研究中，我们旨在开发和验证Simoa SCC-Ag测定技术。

　　单位

　　中国复旦大学上海肿瘤中心

　　研究方法

　　Simoa实验方法开发：按Quanterix Homebrew流程制备带有捕获抗体的磁珠以及带有生物素的检测抗体。抗体标记后在全自动Simoa HD-1分析仪上进行分析验证。

　　Simoa实验验证：实验校准曲线模型检测能力(LoB，LoD和LoQ)，可重复性，线性和检测稳定性。校准曲线的最佳拟合模型是1/Y2加权四参数模型

　　患者样本的收集和检测：92位接受根治性子宫切除术的宫颈鳞状细胞癌患者，连续5个时间点采集血清样本：第0天(手术前一天)，术后第4天，2-4周，2-4个月和5-7个月，共收集352个样本来研究SCC-Ag水平的动力学变化及其与临床病理特征的关系。

　　研究结果

　　Simoa实验方法开发和验证

　　免疫分析开发过程包括评估合适的抗体对和优化其反应条件，例如测定缓冲液组成，孵育时间和所用试剂浓度。验证来不同组合的抗原和抗体，以选择合适的校准蛋白和抗体对。结果显示抗体13,218-RP01(Sino Biological)和抗体13,218-T52(Sino Biological)分别用作捕获抗体和检测抗体时，可获得最佳的检测结果。

　　各个校准点的所有反向计算浓度的回收率在93%-113%，根据精密度分析法计算出Simoa SCC-Ag测定的LoD和LoQ，分别为0.029和0.057 ng/ml，6个样品的批间CV在3.7-8.8%，批内CV在5.1-13.7%。高浓度和低浓度的SCC-Ag在人血清样品的线性回收率为83.5-116.9%。在标准曲线下，Simoa  SCC-Ag测定的动态范围0.029–100 ng/mL。稳定性测试表明，校准蛋白在-20°C下稳定，回收率在106%至119%之间(图1)。

　　Simoa SCC-Ag分析满足了临床和实验室标准协会(CLSI)常用指南中规定的所有指定验证参数的标准。方法学的验证表明，SimoaSCC-Ag分析法可以满足复杂基质(例如人血清)的检测所需的重现性和可靠性。

　　图1: Simoa SCC-Ag检测的标准曲线和验证

　　Simoa和Architect SCC-Ag分析之间的对比

　　352个样本同时在在Simoa平台和雅培的Architect SCC-Ag进行了分析测定，以评估Simoa和Architect分析之间的差异。Simoa测量的SCC-Ag水平与Architect测量的结果高度相关(Pearson相关系数= 0.979)(图2)。Passing-Bablok回归的斜率和截距分别为0.894(0.847至0.949)和−0.009(-0.047至0.027)。在Architect和Simoa平台中SCC-Ag的最小值分别为0.17 ng/mL和0.16 ng/ mL。

　　图2: Simoa与Architect的SCC-Ag检测结果高度相关

　　术后患者血清中SCC-Ag的动力学数据

　　Simoa在每个时间点(第0天，第4天，第2至4周，第2-4天，第5至7个月)SCC-Ag的检测中值分别为2.49 ng / mL，0.66 ng / mL，0.61 ng / mL，0.72 ng / mL和0.71 ng / mL，手术后SCC-Ag水平急剧下降，然后趋向于稳定(图3)。

　　图3: 术后患者血清Simoa SCC-Ag水平

　　在92位患者中，32位患者成功收集到在所有时间点血清样本。描绘了32例患者的SCC-Ag值。根治性手术后，这32位患者的SCC-Ag均急剧下降，然后SCC-Ag开始相对缓慢地变化。某些患者中，术后1个月内体内SCC-Ag表达开始升高;其他患者中，SCC-Ag表达在1-3个月内才开始增加;也有患者，SCC-Ag表达直至3个月都没有表现出增加。

　　图4A：32位患者的血清SCC-Ag水平变化

　　评估SCC-Ag值与临床病理特征之间的相关性

　　术前SCC-Ag水平与FIGO分期，基质浸润和淋巴结转移有统计学意义，但与LVSI无关(P = 0.074)。术后LVSI阳性和淋巴结转移的患者在第4天和第2-4周时SCC-Ag表达水平高于未患该疾病的患者。而这些组之间的SCC-Ag表达水平差异在2-4个月和5-7个月并没有达到统计学意义。但这些结果表明，术前SCC-Ag表达水平可能反映了肿瘤的负荷，而术后SCC-Ag表达水平主要表明了通过淋巴引流的肿瘤转移。有趣的是，完成治疗后，低危组，中危组和高危组的SCC-Ag表达都达到相同水平。

　　表格2: 不同时间点的血清SCC-Ag值与临床病理特征之间的相关性

　　淋巴结阳性和阴性的患者术后1个月内SCC-Ag表达水平存在显着差异，而2-4个月后则无显着差异。所有有淋巴结转移的患者均接受术后辅助治疗。因此，基于淋巴结转移和术后治疗，使用广义加性建模(GAM)技术进一步评估了SCC-Ag动力学趋势。在控制了年龄，肿瘤大小和辅助治疗后，淋巴结阳性患者的SCC-Ag表达(P <0.001)明显升高(图5b)。此外，控制年龄，肿瘤大小和淋巴结状态后，较高的SCC-Ag表达与术后辅助治疗相关。但是，在术后接受佐剂治疗的患者和未接受治疗的患者之间，SCC-Ag表达水平的动力学趋势发生了显着变化(P = 0.005)(图5c)。ANOVA进一步证明了术后治疗趋势的改变。尽管接受术后辅助治疗的患者的SCC-Ag表达明显高于未经治疗的患者，但两组之间的差异在辅助治疗完成后消失(双向ANOVAp = 0.56)。所有数据表明，通过Simoa分析检测到的SCC-Ag水平可很好地预测疾病的侵袭性和宫颈癌的治疗反应。

　　图4B-C：淋巴结转移以及辅助治疗与SCC-Ag表达水平的关系

　　结论

　　成功开发出Simoa SCC-Ag检测方法，可用来监测宫颈癌患者治疗期间的血清SCC-Ag水平变化。血清SCC-Ag水平可作为宫颈癌状态的很好的预测指标，包括疾病的侵袭性和治疗反应。

　　参考文献

　　Shuang Ye, XiaohuaSun,Huijuan Yang, et al. Dhe kinetic profile and clinical implication of SCC-Agin squamous cervical cancer patients undergoing radical hysterectomy using theSimoa assay: a prospective observational study.BMC CANCER (2020) 20:138