说到肺结核，可能很多人都不清楚这是怎样一种病，但若提起“痨病”就会恍然大悟。鲁迅先生的小说《药》中所描述的“人血馒头”和小栓按着胸口不住咳嗽的一幕，想必在很多人的心底都留下了深深的烙印。

　　根据世界卫生组织发布的《全球结核病报告2019》，全球结核潜伏感染人群约17亿，占全人群的1/4左右，面临着进一步发展为结核病的风险。全球范围内，结核病是导致死亡的十大原因之一。WHO发布的2019全球结核病报告中，2018年估计有1000万人新感染结核：580万男性，320万女性，100万儿童。我国结核病发病人数仅次于印度，在全球排第二位，2018年我国估计有88.9万人新感染结核，是全球30个结核病高负担国家之一。WHO的监测数据显示，每天，约4500人因结核病失去生命，近3万人患上这一可预防且可治愈的疾病。这一数字足够让结核病在传染病领域里“傲视群雄”。

　　上图: 肺结核病临床诊断标准2017最新版

　　结核病的致病菌是结核分枝杆菌，与新冠病毒有着共同的传播途径——呼吸道传播。结核病的诊断, 迄今仍然主要是依靠涂片、培养、X光片检查，或是通过PPD和IGRA等免疫方法辅助诊断。然而痰涂片阳性率低, 细菌培养需时较长, 而且对肺外结核和小儿结核帮助不大。X光片检查受人的主观影响, 正确率较低。结核菌抗原或抗体等免疫法，敏感度及特异性不高，仅用于辅助诊断，并且阳性只提示TB菌感染，不能判断是否为活动结核。因此这些传统的方法, 并不能适应结核病的临床诊断需求，临床上迫切需要一种更灵敏的，特异性更高，同时操作简单的技术，来进行结核病疑似患者的筛查和确诊。

　　上图: PPD/IGRA—临床检测潜伏结核感染(LTBI)的方法比较(免疫)

　　Simoa技术是目前最灵敏的蛋白免疫技术，检测灵敏度达到了fg/ml级别，是传统ELISA的1000倍。下面几篇文章是Simoa技术在结核病领域的应用案例，从标志物发现到辅助临床确诊，Simoa技术的超高灵敏度已经展现了自己的部分优势，也希望越来越多的新技术加入进入，共同抵御这种全球性的疾病。

　　案例01

　　Simoa超敏检测提高临床LTBI诊断的灵敏度和特异性

　　结核素皮肤试验(TST)是用于检测潜伏结核感染(LTBI)的传统方法。自 从干扰素-γ释放试验(IGRA)进入临床应用之后大有取代TST之势。IGRA是在体外检测T细胞经结核特异性抗原刺激之后产生和释放干扰素-γ能力的免疫学技术，藉此判断细胞介导的免疫反应。临床在用的IGRA法对结果不确定的样本需要二次抽血，提取PBMC后进行T-SPOT-TB检测;而Simoa的超高灵敏度，可以从不确定样本中鉴定出真正的阳性和阴性样本。

　　上表：基于两种标准(A)Simoa不确定标准和(B)QFT-Plus标准对结核病疑似样品进行分类

　　注：两种检测方法结果一致的样本个数以粗体字表示

　　Simoa的IFN-γ的灵敏度比临床在用的QFT ELISA的灵敏度提高了约100倍(LOQ：0.002 IU / mL vs 0.169 IU / mL);QFT IFN-γELISA试验结果 (阴性30例，阳性35例，不确定阴性25例，不确定阳性31例，不确定样本30例)

　　Simoa检测结果：83.3%的不确定样本检测为阴性，74%的不确定阳性样本被分为阳性，多数(72%)的不确定阴性样本被重新分为不确定阳性(68%)和阳性(4%)。因此，超灵敏的Simoa干扰素检测可作为一种鉴定阳性和阴性样品的有用工具。

　　参考文献：Assessment of an ultra-sensitive IFN immunoassay prototypefor latent tuberculosis diagnosis . Eur. Cytokine Netw. Vol. 29, 2018, 136-45

　　案例01

　　发现基于外周血的活动性结核病诊断标志物，为实现ATB临床快检提供可行性

　　来自哈佛&麻省理工的研究者通过对结核病患者和对照人群体液及组织标本的质谱比较分析，鉴定出50种在两组人群之间表达具有显著差异的分子标志物，通过后期大样本验证最终锁定4种(IL-6，IL-8，IL-18，VEGF)对结核早期诊断具有价值的生物标志物。与超灵敏的Simoa平台相整合，开发出4重试剂盒，同时对结核病患者外周血中的这4种标志物进行定量分析，发现与现有世界卫生组织推荐的结核诊断产品相比，Simoa表现出极高的灵敏度和特异性，双盲模型验证结果：准确度(ROC-AUC)为0.80，敏感性为80%，特异性65%，并且与结核病合并艾滋病感染人群同样适用，已非常接近WHO的分类检测标准。因此Simoa是非常有前景的诊断产品，后续在越南、南非和秘鲁的多中心评估正在进行中。

　　上图：Simoa 平台检测IL-6，IL-8，IL-18和VEGF

　　参考文献：RushdyAhmad et al, A rapid triage test for active pulmonary tuberculosis in adultpatients with persistent cough, Sci Transl Med 11, 2019.

　　案例

　　Simoa检测结核病患者血浆中的CXCL10水平

　　结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)与人类共同进化了几千年，全世界有近20亿人感染了结核分枝杆菌。结核分枝杆菌感染无明显疾病特征，无法根除。在趋化因子，主要是CXCL10的指导下，Th1细胞会被募集到感染部位，控制感染。前人研究发现慢性丙型肝炎患者血浆中的CXCL10主要以拮抗剂(antagonist)的形式存在，这是由于DPP4酶的N端截短，导致拮抗剂形式的CXCL10能够与其受体CXCR3结合，但不诱导信号。来自丹麦Statens血清研究所疫苗中心等机构的学者研究CXCL10的拮抗作用是否可能对结核发病机制产生影响。

　　选取20名活动性结核病患者(tuberculosis，TB)、10名肺炎患者(pneumonia)以及10名健康对照进入研究，利用超灵敏Simoa平台检测血浆中的总CXCL10(CXCL10total)、激动剂(agonist)形式的CXCL10(CXCL10long)和拮抗剂(antagonist)形式的CXCL10(CXCL10short)的水平。检测DPP4酶活性。发现与对照相比，结核病(TB)患者血浆中总CXCL10(CXCL10total)的和拮抗剂形式的 CXCL10(CXCL10short)水平较高，DPP4酶活性较低。利用免疫组织化学和共聚焦分析结核病灶中多核巨细胞和巨噬细胞的表达追踪CXCL10分泌源，发现这些细胞与DPP4阳性T细胞相关。此外，对结核感染部位淋巴细胞的分析(支气管肺泡灌洗)发现CXCR3+ T细胞的频率降低。

　　结果表明CXCL10拮抗作用可能是结核病病理部位发生的一个重要调节机制。结核病中，CXCL10由结核分枝杆菌感染的巨噬细胞分泌后，迅速被CD4+T细胞膜上的DPP4 (CD26)抑制，降低了CXCL10趋化性。鉴于Th1细胞功能和IFN-γ介导的效应在结核病中的重要性，过往可能忽略了DPP4在结核病中的调节作用，提示作为治疗糖尿病的DPP4抑制剂可以作为结核病和耐多药结核病患者的辅助免疫疗法。

　　上图：Simoa检测血浆中总CXCL10(CXCL10total)、激动剂(agonist)形式的CXCL10(CXCL10long)和拮抗剂(antagonist)形式的CXCL10(CXCL10short)的水平。TB：结核病;Pneumonia：肺炎;Controls：对照。

　　参考文献：Thomas Blauenfeldt, Linda Petrone, Franca del Nonno, et al. Interplay ofDDP4 and iP-10 as a Potential Mechanism for cell recruitment to Tuberculosislesions. Front. Immunol., 05 July 2018.

　　案例

　　Simoa检测结核病患者尿液中IP-10(即CXCL10)水平

　　急需用于诊断和监测结核病的生物标志物。在慢性肝炎中，干扰素/利巴韦林(ribavirin)治疗无效的患者具有高水平的拮抗剂(antagonist)形式的IP-10。最近拮抗剂形式的IP-10也被证明与结核病发病机制有关。来自意大利L. Spallanzani国立传染病研究所(INMI)等机构的科学家研究了激动剂(agonist)/拮抗剂(antagonist)形式的IP-10是否可以用来作为结核病诊断和监测的潜在生物标志物。

　　33名活动性结核病(TB)患者、11名肺炎患者和17名健康对照进入研究，收集晨尿。利用Simoa检测尿液中总、激动剂(agonist)、拮抗剂(antagonist)形式的IP-10水平。发现与对照相比，结核病患者的基线时尿液中的总和激动剂形式的IP-10水平较高;但是结核病患者和肺炎患者尿液中IP-10水平无显著差异。治疗后，结核病患者尿液中总IP-10水平下降，激动剂和拮抗剂形式的IP-10水平也下降但无显著差异。

　　通过Simoa技术，首次发现可以检测尿液中激动剂/拮抗剂形式的IP-10。IP-10水平与结核病和肺炎相关，说明与急性炎症有关。需要进一步的研究来评估IP-10在监测结核病治疗效果中的作用。

　　注：尿液样本收集：用BD Bioscience的真空采血管收集10ml晨尿，然后转移到BD Bioscience的蛋白酶抑制剂管p800中，每管分装1ml，冻存在-80度。

　　上图：Simoa检测尿液中IP-10水平。ActiveTB：活动性结核病;Pneumonia：肺炎;HD：健康对照。Total IP-10：总IP-10;shortIP-10: antagonist IP-10，拮抗剂形式的IP-10;long IP-10：agonist IP-10,激动剂形式的IP-10。

　　参考文献：Linda Petrone, Vincent Bondet, ValentinaVanini, et al. First description of agonist and antagonist IP-10 in urine ofpatients with active TB. International Journal of Infectious Diseases 78 (2019)15–21.