今天和大家分享一篇中科院微生物所的文章，文章介绍了一种基于dLAMP(digital loop-mediated isothermal amplification)的分子检测方法，该方法能够高效地检测牛分枝杆菌Mycobacterium bovis。

　　原文标题：High-performance detection of Mycobacterium bovis in milk using digital LAMP

　　简介

　　牛分枝杆菌可感染动物和人类，并引起人畜共患结核病。牛奶样品中牛分枝杆菌的检测对于有效控制和预防人畜共患疾病至关重要，但目前缺乏有效又灵敏的检测方法。与实时PCR相比，dLAMP为牛奶中的牛分枝杆菌检测提供了更高的准确度和灵敏度(检测时间2小时，检测限14 CFU/mL)，而且更能耐受PCR抑制剂的干扰。dLAMP系统可为食品安全、流行病学研究和临床诊断提供复杂病原体的检测平台。

　　

　　结果

　　2.1 dLAMP和qPCR的灵敏度比较

　　作者使用pEASY-T1-mpb70质粒进行灵敏度的评估。

　　qPCR检测显示加入的模板和测量浓度之间的良好线性(R2=0.9977)，能够检测的模板浓度范围更大。dLAMP在较高的模板拷贝数(>102 fg/μL)时准确度较低，但在较低的模板拷贝0.13 fg下比qPCR更灵敏。dLAMP的检测限为3.88 copy/μL，而qPCR的检测限为31.61 copy/μL。

　　这些结果与先前的研究一致，即qPCR的宽动态范围更大而数字化扩增的灵敏度更高。作者认为高灵敏度对于避免假阴性结果至关重要。此外，可以通过调节液滴体积或稀释样本来扩展dLAMP的动态范围。

　　

　　2.2 dLAMP和qPCR耐受牛奶中抑制剂的能力对比

　　作者通过在反应体系中掺入牛奶来测试抗抑制剂能力。

　　在dLAMP反应中加入<1%的牛奶不会抑制反应。随着牛奶浓度的增加(2%-8%)，干扰逐渐增加，当牛奶浓度达到14%时，dLAMP反应被完全抑制。而qPCR更脆弱，当仅添加痕量(0.03%)的牛奶时，就能观察到严重的抑制作用。

　　下图中的抑制曲线清楚地显示了牛奶对qPCR和dLAMP的抑制作用。牛奶对dLAMP和qPCR的半数最大抑制浓度(IC50)分别为2.85%和0.16%。该结果进一步证明qPCR的定量可靠性很大程度上依赖于DNA模板的纯度和标准曲线。

　　

　　2.3 全脂牛奶中牛分枝杆菌的定量

　　作者通过向牛奶中加入牛分枝杆菌，进一步评估dLAMP在全脂牛奶样品中定量牛分枝杆菌的可行性，同时将掺入牛分枝杆菌的盐水样品作为对照组，以评估牛奶对扩增干扰。

　　结果显示dLAMP在牛奶样品和盐水对照之间有非常接近的结果。梯度稀释样本的定量结果的线性相关性与牛奶为R2=0.9893，生理盐水为R2=0.9836。这表明dLAMP具有较强的抗抑制性能和良好的定量检测稳定性。与dLAMP相比，qPCR在定量方面稳定性不佳，牛奶(R2=0.9420)和生理盐水(R2=0.9479)结果不太一致，线性回归差于dLAMP。

　　

　　值得注意的是，dLAMP的灵敏度(14 CFU/mL)显著高于qPCR(140 CFU/mL)，是qPCR的10倍。同时qPCR的14 CFU/mL测量值(Cq>35)显著高于阴性对照(Cq=34.87)，这表明qPCR的14 CFU/mL定量结果不可靠。

　　

　　作者还发现，通过dLAMP和qPCR测量的浓度高于传统的平板计数。这种差异可能是由于分枝杆菌易于形成团块，在固体培养基上形成菌落的能力不高引起的，并且它们的生长速率随休眠状态的深度而变化。此外，先前在分枝杆菌的定量研究中也有报道，通过培养方法对微生物定量可能低估微生物总数。

　　总结

　　作者开发的自动化系统结合了离心富集、自动化DNA提取和基于界面乳化的dLAMP，可对全乳中的牛分枝杆菌进行绝对定量。这种综合方法极大地简化了牛奶中超低浓度牛分枝杆菌的操作和快速定量，结果表明dLAMP对牛奶中难以去除的污染物的检测限和耐受性至关重要。自动DNA提取的使用大大提高了检测效率，为大规模牛分枝杆菌检测奠定了基础。自动dLAMP方法可以在2小时内分析混有牛奶的牛分枝杆菌样品，检测限为14 CFU/mL。与qPCR相比，dLAMP更灵敏，对抑制剂具有更好的抗性，并且无需标准曲线。

　　作者相信，本研究中描述的dLAMP系统还可以为环境或生理样品中各种病原体的定量和及时分子检测提供强大的平台，为临床诊断、流行病学研究和食品安全检测提供更可靠的指导。

　　感想

　　作者通过数字化核酸扩增(digital nucleic acids amplification)的原理，巧妙地将LAMP这样一种定性的技术变为绝对定量技术，同时还获得了10倍于qPCR的灵敏度以及较高的抗抑制能力。

　　实验采用的分区方法是油包水方法，通过一根特氟龙管在油与空气界面反复上下振动，将管子中的水相通入油相形成稳定的液滴。

　　

　　此方法虽然巧妙耗材也很便宜，但需要一套额外的分区辅助设备，还是不够方便。而且液滴制备过程96孔板一直敞口，存在一定的气溶胶污染风险。受此影响可能在作者展望的各类领域的应用都会有所限制。如果分区方式和我们的Clarity数字PCR一样只需要简单一推，那么dLAMP技术在食品安全、畜牧业、临床诊断和流行病学研究中会有很大的应用前景。

　　杭州纽蓝数字PCR

　　

　　

　　Clarity数字PCR的三个部件和分区原理图

　　Clarity数字PCR采用芯片式分区方式，只需要轻轻一推，便可自动完成分区。得益于方便的分区方式，Clarity数字PCR能够采用开放式设计，本身只包含分区辅助工具、封闭工具和荧光读取设备。其扩增过程可以在传统的PCR仪上进行，省下了一部分仪器费用的同时还获得了独有的开放性和拓展性。

　　在开放式设计的基础上，Clarity数字PCR仪可以结合各类扩增技术。不只LAMP，传统的各种等温扩增方法，都可以借用数字PCR的思想，利用Clarity的芯片进行分区扩增，以实现快速绝对定量。

　　数字PCR优势：

　　1)无需绘制标曲线，可以直接实现绝对定量;

　　2)是目前基因检测方法中灵敏度最高的检测方法，更适合核酸含量较低的样本检测;

　　3)较荧光定量PCR，结果更准确，更稳定;

　　4)抑制因素对数字PCR扩增几乎没有影响，所以适合复杂样本的检测。