支原体检测技术及应用指南(药典法和快检法)

　　Why(检测原因)概述、分类来源、危害

　　检测方法： 培养法，指示细胞培养法，NAT法(核酸快检)申科

　　重点介绍：NAT法

　　不同国家对NAT用于支原体检测的接受程度及NAT验证的质量标准要求

　　NAT方法从检测限(LOD)、特异性、稳定性、可比性等方面进行验证。

　　验证服务

　　培养法：样品检测、培养基灵敏度检查、适用性验证

　　指示细胞培养法：样品检测、适用性验证

　　qPCR法：样品检测、方法验证、适用性验证

　　全面性能验证

　　验证内容：不同的样本基质，不同的宿主细胞DNA，不同的蛋白浓度

　　结果：符合国内外法规要求50%-150%

　　案例分享

　　1. 移液枪的选取

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　　2. 正向移液需要润洗吸头

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　　3. 阴性质控有污染，如何进行环境控制?

　　a. 实验时穿实验服并戴口罩，勤换手套。

　　b. 使用带滤芯移液枪头和灭菌EP管，每次实验尽量更新新的枪头和EP管。

　　c. 分区操作

　　d. 空调开启时，可在实验开始前先开启空调预冷实验室，待进行实验时，将空调风速调至最低。

　　e. 实验过程中先准备阴性对照管、样品管并盖紧管盖，最后准备阳性对照管。

　　f. 勿将扩增产物带至PCR反应液配置区。

　　g. 实验结束后清理桌面，可以用DNA清除剂清理环境。

　　4. 不同实验操作要隔开，避免气溶的产生。

　　可能存在的问题：

　　1. 稀释导致支原体实际含量低于试剂盒检测限。

　　解决：使用Clarity数字PCR可以很好的解决稀释问题，检测的动态范围是0-2240 copy/μl。

　　2. 检测样本的PH值是否验证(如培养基过酸过碱会有影响吗?)

　　解决：Clarity数字PCR检测的总体系是15μl，体系小所加的样本量更少，同时进行分区后在一定程度上将样本进行了稀释，因此样本中其他因素的影响极小。