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Evosep One 联合Thermo Q‐Exactive HF‐X助力CHO细胞中GSH蛋白质组学的相关分析
来源:大分子生物医药网 | 作者:Neoline | 发布时间: 2021-07-21 | 467 次浏览 | 分享到:
来自丹麦科技大学生物技术与生物医学系的研究人员,利用evosep one(30SPD)设备联合Thermo Q‐Exactive HF‐X质谱一天就可完成了在TMT技术当中分馏混合的28个组分中GSH蛋白质组学鉴定,而传统方法则可能需要两天或者更长的时间,大大节约了科研宝贵的时间,鉴定结果重复性高。

  来自丹麦科技大学生物技术与生物医学系的研究人员,利用evosep one(30SPD)设备联合Thermo Q‐Exactive HF‐X质谱一天就可完成了在TMT技术当中分馏混合的28个组分中GSH蛋白质组学鉴定,而传统方法则可能需要两天或者更长的时间,大大节约了科研宝贵的时间,鉴定结果重复性高。

  1、题目

  Characterization of glutathione proteome in CHO cells and its relationship with productivity and cholesterol synthesis

  2、出处

  Biotechnology & Bioengineering 杂志(IF:4.530)

  3、研究机构

  丹麦科技大学生物技术与生物医学系等。

  4、研究背景与目的

  谷胱甘肽(GSH)在维持哺乳动物细胞氧化还原平衡中起着核心作用。以往对CHO细胞系的研究表明谷胱甘肽代谢与无性系生产能力有关。然而,需要一个深入的研究来理解这种关系,并潜在地突出细胞工程的新目标。在该研究中,通过调节CHO细胞生长代谢过程中谷胱甘肽的含量,具体为改变半胱氨酸在培养基的组成,以及使用丁硫氨酸亚砜亚胺(BSO)直接抑制GCL酶,以进一步阐明谷胱甘肽合成途径的作用。

  5、研究方法

  本文通过改变培养基中半胱氨酸的组成,以及使用丁硫氨酸亚砜亚胺(BSO)直接抑制GCL酶两种方法调节细胞内谷胱甘肽水平,进行了氨基酸测定,谷胱甘肽的测定,研究了细胞表型,测量了参与中心碳代谢的代谢产物,并采用TMT技术结合evosep one(30 SPD)和Thermo Q‐Exactive HF‐X进行了蛋白质组学分析。使用Proteome Discoverer (Thermo Fisher Scientific, 2.2版)的TMT报告离子定量和MS Amanda识别算法(Dorfer et al.,2014)对质谱进行处理。MS/ MS数据根据UniProtKB 提供的CHO K1蛋白质组和Global proteome Machine网站提供的污染物公共外源蛋白库进行查询。

  6、研究结果

  

  图1 BSO处理对细胞生长、生产力和谷胱甘肽含量的影响

       灰色和蓝色分别表示对照和低半胱氨酸培养基。圆圈表示未处理的生物反应器,三角形表示经过BSO处理的生物反应器。红色虚线表示BSO加入0.5 mM培养基浓度的时间。(a)活细胞浓度(VCC)剖面。(b)上清液中随时间变化的产物滴度。(c)细胞内谷胱甘肽浓度随时间变化。(d)随着时间的推移,mAb特定的生产力。

  结果表明,在BSO添加后的第3天,CHO细胞系的表型不受GSH消耗的影响。从第6天开始,其生长速率逐渐降低,细胞体积逐渐增大,直到第10天。随着时间的推移,总谷胱甘肽的增加和特定生产力的增加之间存在相关性。除产品效价外,两种处理在生长曲线、蛋白质组学数据、代谢物摄取和生产速率方面均无显著差异。

  图2 BSO处理对葡萄糖、乳酸和丙氨酸摄取/分泌率的影响

       灰色和蓝色分别表示对照培养基或低半胱氨酸培养基。圆圈表示未处理的生物反应器,三角形表示经过BSO处理的生物反应器。红色虚线表示BSO加入0.5 mM中浓度时的时间。

  为了进一步表征GSH的消耗对CHO细胞系代谢的影响,测量了选定代谢物的每日细胞外浓度,并计算了相关的特定摄取和产生速率。乳酸由BSO处理的细胞产生,并被未处理的细胞消耗。在氨基酸摄取/分泌率方面,丙氨酸是唯一一个在BSO处理中与乳酸表现出相似特性的氨基酸。由于乳酸和丙氨酸可以从丙酮酸中产生,这些特征表明三羧酸(TCA)循环的失败或减缓。

图3 BSO处理下CHO细胞中差异表达蛋白的热图

  表1 BSO处理细胞中胆固醇和三羧酸循环相关蛋白的表达


  图4 BSO处理细胞中谷胱甘肽代谢相关蛋白的表达

  分别在第6天和第10天抽取50´106个细胞,使用TMT标记进行蛋白质组学分析。共63个蛋白对BSO反应有差异表达,其中下调蛋白47个,上调蛋白16个。与产品效价和细胞内谷胱甘肽含量相比,低半胱氨酸培养基处理不影响整体蛋白表达。在第一个聚类中,对照组的蛋白表达在第6天至第10天显著增加,而BSO条件下的蛋白表达在第10天仍然很低。在BSO处理后的第6天和第10天最大的蛋白质簇下调,这具体包括胆固醇的生物合成、羧酸代谢和线粒体中氨基酰基t RNA的生物合成。所有参与胆固醇生物合成的酶均被下调,相关转录因子SREBP2也被下调,与TCA循环相关的线粒体蛋白下调。在最后一组(图3)中,观察到了对氧化应激的反应,因为这一组包含了大部分BSO上调的蛋白,包括三个与血红素代谢相关的蛋白。在最后描述的两个聚类中可以找到特异性参与GSH代谢的蛋白质。图4显示了检测到的与GSH相关的蛋白质的更多细节,GSH合成相关蛋白总体上调,尤其是谷氨酸半胱氨酸连接酶调节亚基和S甲酰GSH水解酶。相比之下,一些参与谷胱甘肽消耗的蛋白质,例如用于谷胱甘肽解毒或分解代谢的蛋白质,总体上被下调。

  7、研究结论

  随着生物过程的推移,细胞内谷胱甘肽和效价之间具有相关性。对BSO处理细胞和未处理细胞之间代谢物摄取/分泌率的分析和蛋白质组的比较表明,三羧酸循环的减缓导致了细胞外环境中乳酸和丙氨酸的分泌。此外,GSH相关蛋白质组的改变与谷氨酸半胱氨酸连接酶调节亚基的上调和特定的谷胱甘肽转移酶Mu家族的下调相适应。本研究揭示了BSO对谷胱甘肽的调节也影响了脂类的生物合成,特别是在蛋白质分泌中起作用的胆固醇。

  参考文献

  Chevallier V, Schoof E M, Malphettes L, et al. Characterization of glutathione proteome in CHO cells and its relationship with productivity and cholesterol synthesis[J]. Biotechnology and bioengineering, 2020, 117(11): 3448-3458.


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