文章：Systematic comparison of single-cell and single-nucleus RNA-sequencing methods

　　Journal：Nature Biotechnology

　　IF： 39.080

　　文章链接：https://www.nature.com/articles/s41587-020-0465-8

　　一、单细胞测序的方法评价标准

　　1.the structure and alignment of reads to the nuclear and mitochondrial genomes(核和线粒体基因);

　　2.sensitivity in capturing RNA molecules(捕获精度);

　　3.extent of multiplets (assessed in mixture experiments)(混合实验评估);

　　4.their technical precision/reproducibility with respect to expression estimates(重复性和精度);

　　5.the ability to recover meaningful biological distinctions in cell types (for PBMC and cortex experiments)(鉴定细胞类型的能力)

　　二、单细胞测序的方法评价实验方案

　　

　　上述表格展示了本文的实验方案组合：分别采用三种不同类型的材料，每种材料包含2个重复，测试了其中单细胞测序的实验方法。其中低通量测序包含2种，5高通量的方法。

　　三、单细胞测序的方法评价材料选取

　　

　　上述图片展示了本实验的材料设置方案;分别对应的人鼠细胞系的混合样本，人类的外周血PBMC，小鼠大脑皮层的细胞核。

　　四、单细胞测序的方法的选取

　　

　　上述图片展示的文章用到的单细胞测序的实验方法：包含2种低通量的smart-seq和CEL-seq，5种高通量的10X Chromium、Drop-Seq、Seq-Well、inDrops、sci-RNA-seq 。

　　五、单细胞测序的方法评价体系的建立流程

　　

　　上述展示了单细胞测序后的分析流程：首先建库测序，得到Fastq文件，比对分析，统计UMI(每个细胞一个ID)获取表达矩阵，质控细胞，聚类分析，细胞类型注释。

　　六、评价结果分析-UMI的分布统计

　　

　　上述图片展示6种方法，在两种混合细胞测试下，分别检测到的人类细胞系和小鼠的细胞系的UMI数目。其中，低通量的单细胞测序方法CEL-Seq2的数目较高，其他方法的水平较为一致。smart-seq测序原理有区别，不存在umi。

　　七、评价结果分析-基因数的分布统计

　　

　　上述图片展示7种方法，在两种混合细胞系测试下，分别检测到的人类细胞系和小鼠的细胞系的gene数目。其中，低通量的2种单细胞测序方法的数目较高，其他方法的水平较为一致。

　　八、评价结果分析-多细胞率的分布统计

　　

　　上述图片显示的是两种在混合细胞体系的实验组多细胞率的变化趋势。结果显示，smart-seq随着细胞数目的增加而不断增加的趋势。sci-RNA-seq表现出不太稳定，而其他方法的双细胞率表现比较稳定。

　　九、评价结果分析-各组分的细胞占比

　　

　　上述图片展示的结果显示，低通量单细胞测序方法获得的细胞类型的完整较高，而高通量单细胞测序显示，10X方法得到的细胞类型的效果与低通量的单细胞测序得到的结果相当。

　　十、评价结果分析-细胞类型完整性评估

　　

　　上述图展示的是通过AUC(机器学习模型评估指标)评估显示，10X单细胞测序在获取细胞分型的效果是最好的。

　　总结：

　　在低通量单细胞测序显示的结果看，在深度上占据较高的优势，特别是单个细胞测的的基因数，但在细胞类型上，有一定的偏好性，存在不完整的可能性，分群评估显示个别群体差异还是比较大的，通量上存在巨大差距。

　　高通量的测序方法对比显示，10X在物种方法中表现的效果综合评判是最佳的，主要体现在稳定性，测序深度，细胞类型的完整度及拟合度都表现出较为好的效果。