本文主要介绍LIBRA-Seq研究抗体表征的应用。下面的两个案例是10X的客户正在进行的实验，客户称其为DRAb-Seq。可以理解为以LIBRA-Seq为基础，并将LIBRA-Seq中的抗原换为已知抗原突变体的一套工作流程。用以探讨现有的抗体或者免疫细胞，识别突变型的潜力。或者是将LIBRA-Seq中的抗原换为已知的抗体药物，观察人体对其的免疫应答反应。

　　由于实验文章没发，细节目前还不清楚，10X的培训里也只有以下两个案例。需要强调的是10X Seminar中的抗体表征与日常理解的抗体表征意思似乎不太一致。以往抗体表征指的是：分子量的测定、糖型的注释、聚集体分析、电荷异构体分析、翻译后修饰、二硫键的确认等。而10X传达的意思是抗体与抗原特异性结合的位点信息等。

　　1、案例1

　　Pembrolizmab帕博利珠单抗(商品名Keytruda，俗称K药)默沙东的K药，

　　Nivolumab纳武利尤单抗(商品名Opdivo，俗称O药)，以及其他的PD-1候选药物。

　　利用6种oligo标记，分别表示6种PD-1的点突变体。这样就能够表征一个给定的PD-1抗体，并且能了解到抗体是和PD-1、PD-L1的哪一部分结合。不仅如此，LIBRA-Seq抗原也可以用于评估临床候选抗体结合群体水平代表性变异的潜力。比如说人类变异数据库Human variation database，当中有82种PD-1的已知变异。通过将变异的PD-1作为LIBRA-Seq的抗原，研究人员就能够评估单抗药物是否能够结合这些PD-1变异型。

　　对于现有的抗体进行标记，可以应用在产生抗体应答的患者中，从患者体内提取出具有治疗和研究价值的药物特异性抗体。

　　2、案例2

　　Adalimumab阿达木单抗(商品名Humira，缩写ADL)

　　同样的原理，用Oligo标记不同ADL突变体，并作为LIBRA-Seq或DRAb-Seq中的抗原。DRAb-Seq的抗原能够用于分离抗药物的抗体，这些抗体能够用于中和有毒副作用的临床抗体，或者是分析候选药物的新变异。

　　通过使用新分理出的药物特异性的抗体，我们可以评估：

　　患者的药物特异性抗体是否结合了这些重组抗体(即抗体药);

　　分析现有的患者样品，了解重组抗体能否与患者B细胞结合，这样能够重新设计或者重新利用现有的抗体组合。并且能够根据新标靶，再次筛选现有的抗体组合。

　　3、与杂交瘤技术的对比

　　下面的详细介绍中我用两种颜色区分杂交瘤技术和单细胞技术，单从篇幅上大家应该就能看出单细胞技术筛选的便利性。

　　杂交瘤技术用于产生对目标抗原具有特异性的单抗的方法。由脾脏淋巴细胞和永生骨髓瘤细胞进行融合后产生。杂交产生的杂交瘤细胞是同质的，只能识别单个表位。但是通过此技术筛选过程非常漫长，需要几个月的时间。

　　首先需要抗原注射对小鼠进行免疫，通常2-3周进行一次免疫。免疫数周后获得样品来测量血清的抗体，用ELISA或者流式细胞仪测定抗体滴度。如果滴度不够高还需要继续增强免疫。当血清中抗体浓度足够高时，对免疫的小鼠实施安乐死，取脾脏获得B细胞。最后使B细胞与骨髓瘤细胞融合。融合效率很低，可能99.5%的细胞可能无法存活。一般杂交瘤过程只能回收对单个抗原具有特异性的杂交瘤细胞。

　　单细胞技术则在细胞种类上有了极大突破，不必局限于脾脏细胞和骨髓瘤细胞，几乎与所有组织和模型生物的单细胞悬液兼容，例如淋巴瘤活检、珍稀细胞活检、FNA抽取物、PBMC等。单细胞技术则能并行筛选多种抗原，并且能在一天内通过流式细胞仪、磁力分选等方法对细胞进行预分离。单细胞技术通过直接富集特异性B细胞，可以大大提高候选细胞数。单细胞实验则在一天内就能够通过VDJ测序完成抗原捕获文库构建的。之后NGS测序2天，分析2天。就能获得经过验证的、表达就绪的天然全长序列。

　　LIBRA-Seq完成后，杂交瘤技术还有3-4周的工作要做：用培养法克隆杂交瘤细胞系，或者通过腹水来稳定这些克隆。然后通过多轮连续稀释，并使用ELISA或者WB来分析培养上清中的抗体。通过反复培养和筛选，整个过程才能够筛选出稳定的细胞系。

　　如果要回收抗体，则还需要4-6周时间，有大量的96孔板要处理。成本大约0.5k-10k美元/克隆。杂交瘤技术最后细胞回收率会很低，经过多步骤实验和筛选，能够得到的细胞很少。

　　最后还需要进一步的亚筛选和亚克隆，来确保从杂交瘤的候选物中，甚至噬菌体展示流程中回收序列。再进行人源化、模板化、工程化，成为了合适的可变区基因之前，必须还要再进行其他的验证，然后才能进行重组表达。才能再去评估交叉反应性和精细的表位特异性等。所有的这些，其实在最开始的原代细胞中就能够一次性完成。

　　4、LIBRA-Seq和其他方法的比较

　　1.能够与所有细胞悬液兼容;

　　2.可获得天然配对的全长序列;

　　3.能够与所有物种兼容;

　　4.关键耗材只需要一张芯片;

　　5.65%捕获率;

　　6.获得的细胞总数高;

　　7.同时评估多种抗原特异性;

　　8.能够映射到抗原表位序列。