结直肠癌(CRC)预后的隐匿性转移的预测，是迫切需要研究的。目前，大量的注意力集中在利用肿瘤标本的基因表达谱作为预后生物标志物发现的出发点。在我们的研究中，我们选择基于通路中的功能性蛋白作为生物标志物。因为正是这些蛋白形成了控制细胞生长、运动、凋亡、存活和分化的功能信号网络。我们使用激光捕获切割(LCM)获取CRC肿瘤标本进行反相蛋白微阵列(RPPA)分析，来描述转移性CRC和非转移性CRC患者的关键细胞信号通路。我们的结果表明，EGFR和COX2信号通路在转移性原发CRC患者中表现出差异激活。如果在更大的研究中得到验证，这一途径可能是有用的预后临床工具，以及潜在隐匿性肿瘤的治疗或预防策略的指南。

　　题目

　　Multiplexed Cell Signaling Analysis of Metastatic and Nonmetastatic Colorectal Cancer Reveals COX2-EGFR Signaling Activation as a Potential Prognostic Pathway Biomarker

　　出处

　　Clinical Colorectal Cancer

　　研究机构

　　美国乔治梅森大学和意大利帕多瓦大学

　　简介

　　虽然人们普遍认为肿瘤细胞的转移是实体肿瘤致死的主要原因，但对于单个患者来说，影响肿瘤转移的时间、概率和器官分布的分子层面因素却知之甚少， 结肠癌(CRC)尤其如此。原发性肿瘤组织的基因转录分析已有报道，提供了结肠癌转移和生存期相关的预后信息。

　　然而，这些基因转录分析的研究结果只是间接的提供了癌细胞内蛋白质信号通路状态的信息。在控制增殖、凋亡、运动、存活和血管生成的细胞信号网络中包含了很多新兴的分子靶向治疗的靶点。尽管这些信号通路对癌症转移有着很高的重要性，但尚未对结直肠癌原发病变(如转移和非转移)中的细胞信号通路状态进行详细分析。这种细胞信号分析不仅提供了预后相关的信息，也提供了侵袭性表型发生转移之前的治疗调节的线索。

　　在本研究中，我们应用了与激光捕获显微切割(LCM)相结合的反相蛋白微阵列(RPPA/RPMA)技术分析转移性和非转移性结直肠癌细胞中信号通路蛋白的激活(磷酸化)状态。使用一组转移性结直肠癌患者的肿瘤样本与那些非转移性的结直肠癌的患者相比，确定与转移倾向相关的候选的细胞信号通路生物标志物，从而提供预后和治疗的策略和方法。

　　材料方法

　　临床样本收集和处理

　　从位于意大利帕多瓦大学肿瘤外科科学系ClinicaChirurgicaII的综合组织生物库中，共选择34例转移性CRC和18例非转移性CRC的患者进行分析。根据组织可用性和苏木精和伊红染色的评价选择病例，以确定足够数量的激光捕获显微切割(LCM)的肿瘤上皮组织样本。 组织样本是在1992年至2003年期间在意大利帕多瓦大学肿瘤和外科科学系ClinicaChirurgicaII手术期间收集的，获得了全面的机构审查委员会的批准以及病人的同意。手术标本在手术切除后5分钟内快速冷冻，以尽量减少术后分子信息的任何变化。一位经委员会认证的病理学家证实了每个样本中存在肿瘤。在平均随访3至5年内，没有出现转移的CRC患者一直没有复发。如表1所示。

　　表1临床样本信息

　　激光捕获显微切割技术(LCM)

　　为了确保通路信息的真实度，进行细胞信号分析所选取的样本是高富集(95%纯度)的肿瘤上皮细胞群体。组织样本最初保存在液氮中，随后在-80°C处保存，直到实验开始。每个样品在70%乙醇中固定后初步处理成8微米厚的切片，用苏木精染色，随后乙醇和二甲苯脱水。在70%乙醇和苏木精染色溶液中加入完整的蛋白酶抑制剂片，以减少蛋白活性变化。所有冷冻组织标本均采用LCM处理。使用LCM系统进行激光捕获显微切割，获得肿瘤细胞群体(图1)。在每张肿瘤组织样本切片的不同部位使用LCM获取细胞群体，52例样本总共获取了20000个细胞并储存在显微解剖盖中，-80°C保存。

　　图1  A)结直肠癌组织染色标本切片  B)激光捕获显微切割(LCM)结肠肿瘤上皮细胞   C)LCM后的结直肠癌组织染色标本切片

　　反相蛋白微阵列(RPPA)的构建与分析

　　反相蛋白微阵列的构建如下。在75°C、30min条件下直接将LCM获取的细胞从盖上裂解到缓冲液中，缓冲液包括2×Tris-甘氨酸 SDS样品缓冲液、组织蛋白提取试剂和β-巯基乙醇。然后将样品煮沸，4°C存放。用2470 Arrayer的350mm直径的实心针在硝化纤维覆盖的玻片打印细胞裂解液。每个样品打印两份，包含5个稀释梯度，从而确保线性检测范围包括所选择的抗体浓度。将表皮生长因子(EGF)处理和未处理的A431人鳞状细胞癌作为抗体染色特异性的内部质控，与实验样品一起打印到玻片上。，玻片在-20°C下保存。封闭处理后的玻片微阵列在自动组织染色机上用催化信号放大系统试剂盒进行抗体的孵育和染色。如图2。

　　图2抗体染色后扫描图像表2A和2B 使用的抗体信息

　　染色过程中使用的每一种抗体都是用Western blot验证过的，具有与目标分子量相对应的单一的条带，抗体来源参见表2A和2B。每个样品的总蛋白浓度是通过SyproRuby蛋白印迹染色确定的。染色后的微阵列玻片在600dpi下使用扫描仪进行扫描，扫描后的结果保存为TIFF文件。用蛋白微阵列分析软件对抗体染色玻片的TIFF图像进行分析，该软件支持斑点查找、局部背景减法、复制平均和总蛋白归一化，最终为每个样本生成一个值。

　　统计分析

　　使用SAS软件进行统计分析和评估两组间终点信号强度的差异。

　　结果

　　对LCM获取的52个CRC手术组织标本进行了综合性的细胞信号分析。其中34例出现肝转移，18例在报告和随访期间没有转移性疾病。每个样品用RPPA技术分析81种重要的总蛋白和磷酸化蛋白的表达信息，这81种蛋白在调节细胞周期、有丝分裂、促进生存、凋亡和运动方面具有重要作用(表2)。虽然这些蛋白的选择并不能完全覆盖整个信号通路，但这些蛋白反映了重要的癌症相关信号通路。如图3所示，在分析的81个蛋白中，只有9个在非转移性CRC和转移性mCRC之间具有显著性差异。在这9种蛋白中，有6种蛋白或磷酸化蛋白：COX2、pAKT(T308)、pBAD(S112)、PC-Abl(T735)、pEGFR(Y992)和pERK(T202/Y204)在转移性mCRC队列中表达或激活较高。相反，在非转移CRC组中：pBAD(S136)、pPAK1-pPAK2(S229/204,S192/197)和pPKC zeta-lambda (T410/403)的磷酸化水平较高，如图3所示。

　　图3 转移性结直肠癌患者原发肿瘤中的蛋白信号改变

　　值得注意的是，我们发现：在转移队列和非转移队列的蛋白的表达或激活中，那些发生明显改变的蛋白构成了一个紧密相连的信号网络。如图4所示。

　　图4 转移性的原发CRC的信号网络改变

　　这些结果表明，发生肝转移的原发CRC肿瘤细胞内蛋白的变化形成了一种通路缺陷，而异常的通路激活可以促进生存和抗凋亡信号的产生(图4)。用不同的分析方法(Western blot)验证了转移性mCRC肿瘤内磷酸化ERK1/2的升高，同时也证实了RPPA的发现(图5)。

　　图5 用WB验证RPPA结果

　　讨论

　　我们的结果表明，转移性原发CRC具有独特的蛋白质信号通路表型，可以与非转移性CRC区分开来。虽然我们一次分析了几十个磷酸化事件，覆盖了许多被认为在肿瘤发生、侵袭外和转移过程中很重要的信号通路，但我们确定了一小部分具有统计学意义的转移相关蛋白。许多差异表达的蛋白存在于一个单一的相互连接的信号途径中(图4)。由于这些蛋白是连接通路的重要组分，我们可以推测该通路本身可能是一种新的预防疗法的靶点，旨在抑制肿瘤的早期转移。理想情况下，抑制整个通路的最佳方法是针对同一通路内不同“节点”的治疗药物的组合。这种组合一般会优于单药疗法。

　　在我们的研究中，我们发现发生肝转移的患者与那些非转移性的患者相比， 信号网络中的EGF受体(EGFR)和COX2等几个关键信号蛋白在原发CRC肿瘤中被更高的激活/磷酸化。众所周知，EGFR(Y992)的磷酸化水平的显著增加伴随着在下游EGFR通路底物ERK(细胞外信号调节激酶)激活和AKT的T308的磷酸化的增加。用RPPA(图5)在转移性患者的肿瘤中观察到ERK磷酸化增加，用Western blot进行了验证。此外，我们发现另一种促存活蛋白cAbl也参与了AKT的激活，在转移性患者的原发CRC肿瘤中，cAbl的T735的磷酸化升高。我们也发现在转移性患者中AKT和ERK激活所引起的下游通路BAD(S112)的磷酸化激活。BAD(S112)的磷酸化激活由EGFR的激活介导的。EGFR在Y992上的磷酸化已被报道是防止受体内吞导致其失活的关键控制步骤。通过减少EGFR的降解，EGFR的磷酸化可以引起下游MAPK和AKT信号的长时间刺激(这是本研究的结果也揭示的)，并最终导致细胞增殖和存活能力的总体提高。值得注意的是，BAD的S136和PAK1/2的S119/204/S192/197上的磷酸化在没有没有发生转移的患者的肿瘤中实际上更高。虽然这一结果将需要在更多的肿瘤中得到验证，但这一发现可能是细胞信号网络中复杂的反馈机制的结果，即蛋白磷酸化的调控伴随着磷酸酶活性的增加和/或蛋白质降解途径的增加。这些反馈机制可能在具有较高转移倾向的肿瘤中发生改变。

　　虽然EGFR的酪氨酸992位点的磷酸化水平增加，但在转移性肿瘤和非转移性肿瘤之间，EGFR的总水平没有统计学差异。 此外，对EGFR的总水平以及Y992、Y1173和Y1148位点的无监督分析表明，EGFR蛋白的总量与这些位点的受体磷酸化水平无关(图6)。

　　图6 总EGFR和关键磷酸化位点的聚类分析

　　聚类分析表明Y992位点与转移性CRC具图6 总EGFR和关键磷酸化位点的聚类分析 有相关性，因为那些磷酸化水平最高的肿瘤(图6，红色)都是转移性CRC。总的EGFR与EGFR的受体磷酸化位点之间相关性的缺乏可能是最近在讨论的关于通过检测总的EGFR在确定EGFR导向治疗CRC的结果(如西妥昔单抗)的原因。

　　研究了环氧合酶2(COX2)在胃肠道肿瘤发生发展中的作用。COX2是一种可诱导的酶，能够催化花生四烯酸转化为前列腺素。前列腺素通过转化生长因子-A配体诱导COX2，促进EGFR的激活。在某些胃肠道癌中，前列腺素介导的EGFR的激活已被证明是支持上皮转化并获得侵袭性表型的现象之一。

　　血管生成是转移起始所必需的，迁移是入侵所必需的。这两种表型都与COX2和EGFR直接或间接相关。COX2在肿瘤扩大的内皮细胞增殖中起作用。这种血管生长是在COX2刺激下局部产生血管生成细胞因子VEGF、白细胞介素6和8以及诱导型一氧化氮合酶所介导的。

　　针对COX2的抗炎药物和针对细胞因子受体的激酶抑制剂，如EGFR和血管内皮生长因子，已被用于临床试验，以优化CRC患者的治疗，目前被认为是治疗该疾病晚期的标准。由于我们确定了似乎EGFR-COX2的通路紊乱是在一个共同的网络内相互连接的(图4)，因此我们提出了联合治疗的概念。最近，研究表明，与单独抑制COX2或EGFR相比，COX2抑制剂与通过丝裂原活化蛋白激酶抑制下游EGFR信号通路相结合，能够在CRC细胞系中显著产生协同凋亡。其他研究证实了这一发现，并表明在体外和体内模型中，COX2抑制剂与EGFR抑制剂的结合不仅能够增强癌细胞死亡诱导同时也可以防止癌症的进展。

　　我们的研究结果表明，诊断出来的携带表达EGFR-COX2信号通路增强激活的原发肿瘤患者表现为远端转移类型。 我们正在做更大的肿瘤研究(包括来自后来在随访时发生不合时宜的肝转移的患者的CRC原发肿瘤)，我们发现COX2和EGFR的抑制剂的临床试验组合可能是治疗隐匿性CRC患者的一个有趣的考虑因素。这种试验的目的是确定原发肿瘤(可以通过手术去除的)中的一个信号通路的改变是否能阻止或减缓隐匿性转移肿瘤细胞的生长。这项初步研究强调了信号通路途径中的蛋白在CRC临床治疗中可能发挥出两个潜在重要作用：一个是判断哪些患者有较高概率出现隐匿性转移，另一个是提供一种基于分子的治疗隐匿性转移性肿瘤的治疗靶点。

　　参考文献：

　　Mariaelena Pierobon. Multiplexed Cell Signaling Analysis of Metastatic and Nonmetastatic Colorectal Cancer Reveals COX2-EGFR Signaling Activation as a Potential. Clinical Colorectal Cancer, 2009,Vol. 8, No. 2, 110-117