研究背景

　　自2020年8月16日以来，严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2 (SARS-CoV-2)在全球已感染超过2100万人。SARS-CoV-2抗原检测在识别活动性感染和监测疾病进展方面具有潜力，但它们与PCR和血清学检测相比仍尚不完善。

　　尽管逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测仍是诊断COVID-19的金标准，但它不能提供有关疾病进展的充分信息。在患者血清转化或恢复后的数周内，RT-PCR检测仍可给出阳性结果。血清学检测可识别已产生免疫应答的个体，但不一定用于监测疾病感染的早期阶段。SARS-CoV-2抗原检测可以补充PCR和血清学检测，通过检测生物液中的病毒抗原识别活跃感染或监测疾病进展。定量且超敏感的SARS-CoV-2抗原检测可检测血液、唾液或NP拭子中的病毒抗原，并与血清学检测相结合，可分析COVID-19从早期感染到血清转化的进展。

　　研究方法

　　为了解决定量抗原检测的需求，我们开发了S1、S1-S2胞外结构域(spike)和核衣壳(N)的超灵敏单分子阵列(Simoa) SARS-CoV-2抗原检测方法。采用单分子阵列法(Simoa)定量检测冠状病毒病(COVID-19)患者血浆中SARS-CoV-2尖刺、S1亚基和核衣壳抗原。选择64例COVID-19阳性患者、17例COVID-19阴性患者和34例大流行前患者的血浆。结合Simoa抗SARS-CoV-2血清学检测，对39例COVID-19患者的272个纵向血浆样本中31个SARS-CoV-2生物标志物的变化进行了量化。数据通过分层聚类分析，并与纵向RT-PCR检测结果和临床结果进行比较。

　　Simoa检测是在HD-X分析仪(Quanterix)上按照制造商说明和前面描述的自动三步分析格式进行的。

　　研究结果

　　对于SARS-CoV-2抗原Simoa检测，三种类型的荧光染料编码磁珠，针对每种病毒抗原的抗体功能化，并与上文所述的血浆样本孵育，用于Simoa的多重测量。【SARS-CoV-2 Simoa抗原检测结果为S1、spike和N抗原，检出限分别为5pg/mL (0.07pmol/L)、70pg/mL (0.39pmol/L)和0.02pg/mL (0.4fmol/L)。】我们检测了抗SARS-CoV-2免疫球蛋白(总IgA、IgM和IgG)，以确定病毒抗原与免疫球蛋白水平之间的相关性。

　　为了检测血浆中是否存在病毒抗原，使用SARS-CoV-2 Simoa抗原检测方法检测COVID-19阳性患者的样本中的S1、spike和N。这些患者经NP-RT-PCR检测为COVID-19阳性，所有血浆样本均在首次NP - RT-PCR检测后10天内获得。64例COVID-19阳性患者中有41例检测到S1和N，我们确定他们为病毒抗原阳性。

　　为了解感染后抗原和免疫球蛋白水平如何随时间变化，对COVID-19阳性患者进行了纵向研究，监测39名住院患者的连续血浆样本中的病毒抗原浓度(S1、spike和N)和免疫球蛋白水平(总IgA、IgM、IgG和IgG1- 4)，所有患者均经NP - RT-PCR诊断为COVID-19阳性。

　　病人出现抗体反应时，随着时间的推移，血浆中的病毒抗原浓度下降，免疫球蛋白水平升高。大多数病毒抗原阳性患者出现了这种趋势。一旦患者发生血清转化，血浆免疫球蛋白水平达到稳定状态，通常无法检测到病毒抗原浓度。所有患者在首次NP - RT-PCR阳性检测后平均7±1天发生血清转化，血清转换后5±1天血浆抗原完全清除。

　　Simoa检测的超敏感性提供了病毒抗原浓度的定量分辨率，使我们能够测量抗体产生的最早阶段，以详细了解患者随时间的反应。

　　聚类图分析，以确定COVID-19阳性患者的抗原和免疫球蛋白水平是否可以区分所有患者的不同感染阶段。聚类图显示了三个优势分支(图3)。第一个分支：大部分早期时间点，观察到高浓度的病毒抗原和低水平的抗体。第二个分支：观察到抗原浓度进一步下降，IgG亚类IgG2和IgG4略有增加。第三分支：患者已经从血浆中清除了病毒抗原，抗体已经达到了他们的稳定水平。

　　观察到在这个队列中的39例患者中，随着时间的推移，IgG1和IgG3的血药浓度出现了大幅度的增加。相比之下，IgG2和IgG4在背景水平上几乎没有变化。IgG1和IgG3都是IgG的亚类，主要对病毒抗原起反应并介导中和作用。根据这些测量结果可知，SARS-CoV-2的免疫系统IgG反应主要由IgG1和IgG3介导，这与之前的血清学研究一致。

　　血浆是一种很容易从住院患者获得的生物液体，但在非临床环境中更难获得。相比之下，唾液是一种非侵入性生物液，更易于用于大规模检测，对于监测病毒抗原浓度以了解COVID-19(一种呼吸道疾病)的活跃病毒感染可能更有意义。他们检测了17位患者的唾液样本，这些患者采用了NP - RT-PCR检测COVID-19。发现与健康唾液对照相比，11名COVID-19患者中有7人检测到S1和N。与在血浆中观察到的抗原和免疫球蛋白类似。

　　结论

　　Simoa提供了一个动态范围，可以在四个数量级的浓度范围内定量抗原。本文报道的SARS-CoV-2 Simoa抗原检测方法是迄今为止首次在COVID-19阳性患者血浆中检测到病毒抗原。这些数据表明，在COVID-19重症病例中，血液中的SARS-CoV-2病毒抗原与疾病进展相关，这些测量为抗SARS-CoV-2抗体的产生和血浆中病毒抗原清除之间的负相关提供了直接证据，这为从住院开始到康复或死亡的病毒感染和免疫应答提供了独特的视角。