一、背景及目的

　　Simoa HD-X进行样本检测过程中，在样本体积充足情况下可自动完成4×稀释操作，但在实际检测过程中会存在多种样本稀释模式，本次测试是为确定同一样本经不同稀释方法/人员操作后对检测数据结果是否存在影响，以指导后续生产实验中的样本处理操作。

　　二、实验设计

　　1、样本准备：

　　测试所用样本为早期客户提供的剩余血浆，便于后期比对数据所有测试条件均使用同一血浆样本完成：800μl血浆样本，混匀，10000g离心5min，取中段澄清分装3管，每管250μl，于-80℃保存备用。

　　2、样本处理条件：

　　相同分装的3管样本分别由3人使用相同试剂进行相同稀释操作，具体稀释操作为：①仪器4×稀释②手动4×稀释③手动4×+仪器4×稀释④手动16×稀释⑤手动64×稀释。

　　3、上机检测：

　　使用Simoa C3PA Advantage Kit(502324)进行实验，所有测试样本均一同上机，所有标曲点与样本一同2重复参与上机检测，试剂盒内参不参与上机检测，详见下表：

　　三、实验操作流程：按Quanterix C3PA protocol及实验室常规技术服务流程

　　四、实验测试数据：

　　注：由于使用三重试剂盒，共有3个因子的测试数据，为避免数据混乱，以下仅展示TNF-α测试数据;1.TNFα标曲数据：

　　标曲R2及CV等质控参数均正常

　　2、样本数据

　　(1)相同稀释条件下不同人员操作数据差异分析：

　　结论1：由现有数据得出，稀释倍数<64倍时，cv值在10%以内。

　　(1)相同稀释倍数，手动/仪器稀释检测数据差异分析;

　　4×稀释条件

　　16×稀释条件

　　结论2：手动/仪器稀释相同倍数，三位操作人员CV值均在10%以下;

　　结论3：4×与16×稀释检测结果存在差异，后续或需进一步验证;

　　(1)手动稀释倍数递增(4×、16×、64×)与仪器稀释检测数据差异分析

　　结论4：手动稀释cv值较大，未做仪器的梯度稀释，暂不能判断是否cv值与稀释倍数呈正相关。

　　(1)选择仪器稀释4×作为阳性对照，比较不同稀释倍数下检测数据差异

　　结论5：以仪器稀释4倍为阳性对照，除与手动4×间cv值<10%，其余cv值均在>20%。

　　五、初步结论

　　现有测试数据可见，样本稀释倍数建议在4×内进行，稀释倍数升高或导致数据准确性偏差。