1、引言

　　癌症治疗的细胞疗法，始于基因编辑过的免疫细胞。例如CAR-T细胞治疗中，对T细胞进行基因工程改造，以表达肿瘤特异性的CAR。作为目前最常用的基因编辑技术，CRISPR在各类研究中发现有望治疗各类疾病，其中不乏癌症。而基于T细胞的基因工程改造方法很多，不限于慢病毒，其中也包含CRISPR方法。

　　CRISPR-Cas9系统适用性广，包括癌细胞、类器官和原代的免疫细胞均适用。

　　10X的Next Gem技术在凝胶珠中加入了Feature barcoding，能够额外捕获带有标记的抗体、配体、gRNA的核酸标记。10X的解决方案能够直接捕获CRISPR扰动，与传统筛选方法相比，大约能快一倍的速度。

　　2、一个里程碑式的研究

　　美国宾夕法尼亚大学和斯坦福大学合作的一篇研究论文。文章开展了多重CRISPR基因编辑T细胞疗法的第一个人体临床一期实验，堪称里程碑式的研究。

　　文章使用10X的单细胞技术作为前期质控和后期监测技术，监控编辑了TCR序列的T细胞(TCR T细胞)的纯度和功能。

　　2.1、文章的流程

　　(1)从受试者体内提取出T细胞

　　(2)基因编辑T细胞，提高T细胞对于癌症的杀伤性

　　(3)回输到受试者体内

　　文章做了4个基因编辑：敲除了TRA、TRB(内源性T细胞受体的α、β基因)和PD-1，敲入了NY-ESO-1(一种肿瘤特异性TCR)。使用5’RNA测序，检测了T细胞的比例、表形以及随时间的演变。

　　2.2、整个流程有几个关键指标需要考察

　　(1)回输前要对工程T细胞进行表征，确认基因编辑后的T细胞是否真的有想要的基因编辑内容;

　　(2)回输前后，各种TCR-T细胞的比例和持续时间;

　　(3)单细胞在不同时间点的基因表达谱是如何变化的;

　　(4)受试者的免疫系统对TCR-T细胞有何响应。

　　2.3、单细胞测序能够对以上问题进行回答

　　韦恩图和堆积柱状图中可以看到各种TCR-T细胞的种类和比例

　　折线图和UMAP可以展示不同时间点对样本进行单细胞分析的结果、评估体内持久性、评估持续性CAR-T细胞的表型

　　B图可以证明，从血液中分离的细胞能够直接进行单细胞研究。被编辑的T细胞在回输人体后数量会下降，然后达到稳定，尤其是蓝色的NY-ESO-1 TCR-T细胞几乎没有变化，说明在该实验条件下的基因工程T细胞免疫原性非常小、基因编辑T细胞用于免疫治疗也是可行的。

　　D图展示了不同时间点NY-ESO-1 TCR-T细胞的基因表达UMAP图。其中TCF7的表达随着时间增加而增加，表明NY-ESO-1 TCR-T细胞是记忆型表型，而不是耗尽型表型。这说明TCR-T细胞有望在患者体内长时间存在。

　　3、优势

　　优势1：更快的周转时间

　　单细胞的优势主要体现在流程中转导之后的过程，将原本的2周时间缩短为3天。同时深度测序变为转录组测序。

　　传统的方法在转导后会使用不同条件对细胞进行选择，筛选出带有gRNA的细胞，同时还必须做一组平行阴性。接着需要做表型的评估、PCR扩增以及深度测序。

　　转导后2-3天就可以开始10X单细胞实验，来评估CRISPR扰动带来的影响，而且是原代细胞的评估。测序方面，因为是鉴定gRNA带有的barcode，因此不需要深度测序。5k raw reads/cell就可以识别gRNA带有的barcode。

　　优势2：更大的扩展性

　　传统方法筛选需要多个平台共同协作，人工需求大，工作繁琐。而且针对的是总体的表型，比如说细胞形状、生存率、增殖和耐药性等;

　　而单细胞测序只需要一个单细胞测序平台，而且是自动化操作、人工需求少。能够获得单细胞分辨率的转录组数据。同时，10X提供的8通道芯片可以并行做8个实验。可以是同一来源，8个不同CRISPR编辑结果的T细胞文库;也可以是同一种编辑的8个不同来源的细胞文库。因此在实验拓展性上更为精细。

　　总体而言：单细胞技术进行CRISPR工程T细胞筛选，具有更快的速度、更高的分辨率更精细的表征、更小的批次效应、更大的实验规模、多重和混合检测能力。