PMID:32580738 IF:13.214

　　单细胞转录组和抗原免疫球蛋白分析揭示了B细胞在非小细胞肺癌中的多样性

　　研究背景：

　　肿瘤的恶性转化是由肿瘤细胞的共同进化及其异常的肿瘤微环境(TME)所驱动的。近期免疫治疗研究表明：免疫治疗可以有效恢复T细胞的抗肿瘤功能，突出了靶向TME特定类型细胞的治疗潜力，但其他类型的免疫细胞功能未被探索。

　　研究结果：

　　本文将从非小细胞肺癌(NSCLC)患者肿瘤组织样本中分离的细胞进行scRNA-seq分析，并鉴定B细胞亚型及其在NSCLC不同阶段的功能。证实了B细胞两种主要亚型：初始B细胞(naïve-like B 也叫成熟B细胞)与效应B细胞共存。初始B细胞在NSCLC晚期中减少，其低水平与预后效果不佳相关。与两株肺癌细胞系共培养由NSCLC患者中分离的初始B细胞显示，初始B细胞能通过分泌4种因子负调节抑制肺癌细胞生长;早期效应B细胞抑制癌细胞生长，但在晚期时促进。通过蛋白组学数据也进一步证实了效应B细胞产生免疫球蛋白及其相互作用蛋白的作用。

　　结论：

　　揭示了B细胞的多种功能及其在非小细胞肺癌中的潜在临床意义。

　　文章概述：

　　免疫治疗的反应性很大程度上取决于肿瘤微环境(TME)特征。TME及不同细胞类型的研究为优化NSCLC个性化免疫治疗奠定了生物学基础。

　　本文对11例NSCLC患者(包括6个Ⅰ阶段和5个Ⅲ阶段)的115,545个单细胞进行scRNA-seq分析，系统性的阐述了肿瘤浸润性B细胞与NSCLC患者临床结果间的关系。鉴定了两种NSCLC的TME中B细胞亚型共存，还进行了功能分析，以确定这两类B细胞在NSCLC中的作用机制，极具治疗潜力。

　　实验结果：

　　NSCLC中免疫细胞浸润

　　对术后立即采集的新鲜肿瘤样本进行scRNA-seq分析，肿瘤样本来自于11例患者(6个Ⅰ阶段和5个Ⅲ阶段)，经胶原酶Ⅳ型消化并去除红细胞、血小板及死细胞后分析得到的115,545个单细胞(流程如下图1a)。不同样本经UMAP聚类分析后，鉴定到了22个细胞亚型，包括T细胞、B细胞、单核细胞、肿瘤细胞、表皮细胞的亚型(如图1 b、d)。

　　C1及C4表达基因与NSCLC良好预后性相关(如图1e、f)，暗示可能抑制肿瘤的功能与这些细胞有关，又进一步关注了非小细胞肺癌TME中B细胞的亚型及其生物学特性。

　　NSCLC中多种亚类B细胞共存

　　进一步分析NSCLC scRNA-seq聚类得到的C4和C6细胞以阐明NSCLC中B细胞特性。使用10×genomics分析PBMCs(外周血)中单细胞数据，整合NSCLC及血液中得到的scRNA-seq数据，B细胞被分为两个主要集群(BC1与BC2)，PBMCs中包含91.8%的BC1细胞与8.2%的BC2细胞，而NSCLC中包含61.8%的BC1细胞与39.2%的BC2细胞(如图2b)。

　　BC1细胞表达初始B细胞的标记基因，BC2细胞表达效应B细胞的标记基因(如图2c)。经比较发现，相较于Ⅰ阶段，Ⅲ阶段的初始B细胞含量更低。

　　初始B细胞与NSCLC预后良好性相关

　　为验证不同B细胞在NSCLC微环境中是否共存，并确定各亚型B细胞的临床相关性，采用免疫组织化学和免疫荧光技术对原始NSCLC组织用CD79A和CD20共复合染色。

　　发现部分细胞同时表达CD79A和CD20，而其余的细胞只表达CD79A。CD20阳性细胞主要位于肺肿瘤组织的三级淋巴样结构(TLS)，而CD79A阳性细胞不仅位于TLS，且在肿瘤组织中随机富集。通过流式分析了30例NSCLC肿瘤细胞(包含ⅠⅡⅢ期各10例)，观察到两种细胞亚型共同存在(如图3c)，且CD20+CD79A+ B细胞在晚期NSCLC中呈下降趋势(如图3b)。

　　使用来源于LUAD TCGA数据库的转录组数据的marker基因对不同时期肺癌的两种B细胞亚型表达情况进行判定。

　　初始B细胞能抑制NSCLC细胞增殖

　　用抗CD20抗体经流式细胞术分选获得NSCLC组织中的原始B细胞以评估原始B细胞对肿瘤细胞的直接影响。

　　NSCLC晚期中效应B细胞促进肿瘤细胞增殖而在早期抑制

　　使用抗BCMA抗体从3个Ⅰ阶段和3个Ⅲ阶段肿瘤组织分选效应B细胞，将效应B细胞与A549与H1299细胞共培养。同样发现在Ⅲ阶段效应B细胞能促进A549与H1299细胞增殖，并且这种机制可能由IgG导致(如下图5a、e)。

　　病理学免疫球蛋白靶点鉴定

　　结论：

　　通过scRNA-seq实验鉴定B细胞亚型，并揭示了NSCLC中肿瘤浸润B细胞多种功能包括：

　　①浸润性B细胞能够被分为明显基因表达特征的两大类;

　　②CD20+ B细胞能够抑制NSCLC肿瘤增长;

　　③在NSCLC早期阶段IgGhighB细胞产生免疫球蛋白可抑制细胞生长，但在NSCLC晚期可能促进细胞;

　　④蛋白质组学分析鉴定了效应B细胞产生的病理性抗体的新靶点和功能;

　　⑤病理性抗体可通过AP2复合物导入肿瘤细胞，并通过TRIM21介导的泛素途径降解其靶点。

　　本文发现了B细胞亚型和免疫球蛋白在调节非小细胞肺癌进展中的多种新见解，突出了在NSCLC微环境中靶向B细胞亚型的潜在临床意义。