CD19特异性嵌合抗原受体CAR-T细胞的免疫治疗在复发/难治性B细胞癌中显示出了卓越的疗效。CAR-T细胞在体内的扩增和持续注射是决定反应和毒性的重要变量，但目前没有一种精准的诊断工具监控Car-T细胞代谢情况。研究表明，数字PCR (dPCR)非常适合于在体内监测CAR-T细胞。本文作者开发一种dPCR检测方法，克隆并测序了从慢病毒tisa-cel载体、axis-cel载体中构建的CAR，并设计了引物和BHQ探针，比较axis-cel (A)、tisa-cel (T)和两种载体通用(U =“通用”)的FMC63 scFv引物探针检测效果。

　　Car-T细胞治疗在血液瘤中表现甚佳，靶向CD19的CAR-T细胞在难治性晚期B细胞恶性肿瘤中表现出卓越的疗效。除了血液瘤之外，目前许多临床实验将Car-T细胞疗法应用于实体瘤。两种CD19-CAR-T细胞产品(Tisagenlecleucel/tisa-cel/Kymriah和Axicabtagene ciloleucel/ axis -cel/Yescarta)已经在许多国家获得许可。

　　一些报告已经证明了利用Axi-cel治疗后，CAR-T细胞的植入、扩张和体内持久性对细胞治疗后的临床结果的重要性。在前28天，CAR-T细胞峰值浓度和曲线下面积(AUC)值与长期疗效相关，相反，在急性和慢性B细胞白血病(分别是B-ALL和B-CLL)中，没有报告、Tisa-cel的AUC和疗效之间的关联(是测定µg DNA的载体拷贝数而不是每µl血液的实际CAR-T细胞数量)。此外，两项细胞研究都发现了临床反应和组织细胞在外周血中的持久性之间的直接联系。总之，现有的数据强调了可靠和准确地定量CAR-T细胞的重要性，以获得可靠的真实数据的两个批准的产品。不幸的是，在很大程度上缺少精确和快速的分析方法。

　　数字PCR (dPCR)的原理在20世纪90年代早期就有了描述，但该技术直到近十年才得到广泛应用，这得益于易于使用的dPCR设备的引入。简而言之，通过将一个聚合酶链反应分割成大量的个体聚合酶链反应(例如，20,000个或者15,000个)，数字PCR使用了有限稀释原理，即将PCR反应分割为数万个独立的个体PCR反应，分割后的结果是要么包含PCR目标序列(记为“1”)，要么不包含它(记为“0”)。与定量PCR一样，目的序列的扩增是基于荧光检测的，但这是在每个分区单独进行;应用泊松校正计算给定样本中目标副本的绝对数量。根据荧光通道的数量，可以对单个样品进行两个甚至更多重检测。dPCR的灵敏度、特异性和重复性极佳，使得该方法特别适用于罕见事件的精确定量。

　　作者开发了一种dPCR检测方法，可以快速、灵敏、准确地定量各种体液中axi-cel CAR-T细胞。在这里描述了新型dPCR的开发、测试和临床应用，包括一种检测源自小鼠抗人CD19抗体FMC63单链片段原始序列的方法。FMC63针对CD19基因第4外显子中的CD19特异性表位。我们发现这种新型的dPCR在定量axi-cel Car-T细胞和tisa-cel CAR-T细胞方面表现优异。

　　实验结果

　　测序确定axi-cel和tisa-cel Car-T全长序列，设计特异性引物探针

　　两种载体构建(tisa-cel和axis-cel)中使用的CAR cDNA方案。相同的序列用浅灰色表示，不同的序列用深灰色表示(Sig =信号肽)。在axis-cel CAR中，使用CD28共刺激域，而不是如图所示的4-1BB域。CD3ζ域因一个点突变而不同，用星号表示(详情见正文)。tisa-cel (T)和axis-cel (A)特异性扩增子/引物的定位如图中灰色箭头所示，而通用(U)引物的定位如图中黑色箭头所示。

　　在2D图中极好地分离了阴性和阳性信号， (y轴:CAR-specific信号，x轴:HCK参考(REF)信号)。

　　用通用引物检测axi-cel产品并进行梯度稀释

　　鉴定axi-cel和tisa-cel Car-T引物探针的特异性、灵敏度和重复性

　　用axi-cel Car-T引物探针检测患者Car拷贝数

　　通过先前报道的axi-cel(axi-Old)试验与新的fmc63定向axi-cel(A)和通用(U)试验进行评估。实验证明，所有三种检测的结果基本上是相同的。

　　CAR-T细胞在axi-cel治疗#015患者的动力学

　　比较dPCR和流式细胞技术的相关性

　　对于两名儿童患者，采用流式细胞术独立的、盲法分析。图4显示了这两名儿童tisa-cel患者采用通用检测方法获得的流式细胞术和dPCR数据(#020，#027，见表2)。显然，两种不同方法测定的CAR-T细胞数量在大多数情况下，dPCR测定的值略高。这些数据强调了该通用检测方法对tisa-cel治疗患者随访的有效性。

　　结论

　　“通用”数字PCR方法非常适合于高灵敏度、精确和重复性的tisa-cel和axi-cel CAR-T细胞检测。使用每µl体液中CAR-T细胞的实际数量可以精准定量体液中Car-T细胞，密切监测CAR-T细胞在体内的数量对于指导患者的后续干预至关重要。

　　参考文献：

　　Accurate In-Vivo Quantification of CD19 CAR-T Cells after Treatment with Axicabtagene Ciloleucel (Axi-Cel) and Tisagenlecleucel (Tisa-Cel) Using Digital PCR