Addgene是一个非盈利性全球质粒共享信息库，它负责保存和提供质粒。今天给大家分享的内容是关于Addgene为什么要放弃qPCR定量AAV，相反选择精准定量技术数字PCR(digital PCR，dPCR)。

自从Addgene开始制备腺相关病毒AAV载体以来，一直在使用qPCR来评估AAV载体的物理滴度，但是该方法需要做大量的重复实验才能证实qPCR定量AAV载体的准确性，甚至作者认为可能需要重复10000次才能实现qPCR定量AAV的准确性，所以Addgene选择使用更精准的dPCR定量方法。

一、qPCR技术定量AAV物理滴度

在深入研究dPCR之前，Addgene很长一段时间都在使用qPCR定量AAV。qPCR定量AAV时，对病毒DNA进行实时扩增和监控，当PCR完成后通过病毒DNA的阈值荧光和标准品的阈值荧光来分析结果。所以利用qPCR定量AAV需要一个已知病毒滴度的标准品AAV作为参考品，来评估未知样本AAV的病毒滴度。

当然了，如果qPCR可以完美地解决AAV定量问题，在这里就不需要使用dPCR方法来定量AAV了。qPCR的一个问题是，针对同一个样本检测结果很可能差2倍，这意味着，如果你用同样的样本建立两个相同的检测方法，最终效价可能是4x10¹² GC/mL 或8x10¹² GC/mL，这两个结果都是有效的。这就是为什么AAV参考品的选择是至关重要的，它可以帮您确定您的滴定度是否在预期范围内。

另外，我们发现，为qPCR绘制一条准确的标准曲线是非常有挑战的。一方便质粒本身有超螺旋、线性和开环状态，其定量结果各有差异，所以Addgene选择使用了相对准确的线性化质粒作为标准品。然而，即使标准品是准确的，它仍然是不稳定的，所以未知样本的检测仍然是不具有高的重复性和准确性。

qPCR定量AAV面临的挑战：

需要标准品才能实现定量，并且准确的标准品的选择具有很大挑战;

绘制一条准确的标准曲线具有很大挑战，且浪费人力;

qPCR定量AAV批次间的误差较大，重复性不好;

然而数字PCR不需要标准品或参考品，这意味着节省了客户大量时间，并且还可以获得很高的数据重复性和准确性。

Figure 1：qPCR定量AAV需要标准品(橘黄色)、NTC(紫色)、参考品(粉红色)，并且每个稀释都需要做重复。dPCR定量AAV只需要一个NTC(紫色)，不需要标准品(橘黄色)和参考品(粉红色)，

二、dPCR技术定量AAV物理滴度

数字PCR技术被誉为第三代PCR技术，可以在不需要标准品的情况下通过数数的方法实现核酸的绝对定量，具有数据稳定性高、重复性好、灵敏度高等特点。数字PCR是将PCR反应液通过数字PCR仪器自动分割成数万个微反应，分割后有些微反应含有DNA模板(记作“1”)，有些微反应分区不含有目标DNA(记作“0”)，PCR扩增后荧光信号积累，通过数阳性信号的方法，便可以知道核酸的拷贝数。在试剂情况中，数字PCR的“数数”是利用泊松分布统计计算出的核酸的绝对拷贝数，大量实验证实该方法的准确性和稳定性。

用dPCR滴定AAV的过程是从稀释病毒开始的。值得注意的是，dPCR的动态范围是每个反应1到100,000个基因组拷贝(GC)。由于AAV的效价一般在10¹²到10¹³ GC/mL 之间，所以在将样品添加到混合反应也中之前，必须先对病毒进行连续稀释。在Addgene，我们通常在dPCR 板上装3份稀释液。由于滴度是未知的，每个稀释应在一个广泛的滴度测定范围内。

稀释后，将检测样本被转移到一个新的含有混合反应液，其中包括引物、探针和dPCR反应酶，buffer 混合液。

使用数字PCR仪器将反应混合液自动分割成10,000-20,000个微反应分区，然后进行PCR扩增，当 PCR 完成后，利用数字PCR阅读器检测每个微反应的荧光强度，发出荧光的微反应单元(1纳升左右)包含着被放大的目标序列。在读取所有微反应之后，软件输出样本荧光图片(图2)。一个干净的dPCR应该有一个明确的分离之间的阳性(绿色)和阴性(灰色)微滴。无模板阴性对照应该没有阳性信号。

三、dPCR定量AAV的优势

1. dPCR定量AAV解决了AAV产品批次误差的问题，可以保证批次间cv<10%.

2. dPCR不需要标准品，定量AAV具有更高的数据重复性和准确性。

3.至少完成200个AAV样本/天

四、ClarityTM 数字PCR系统

利用毛细虹吸原理将混有目标核酸的PCR反应混合液，均匀且独立的分散到8联管芯片中实现分区，接着进行芯片封闭，其后放入普通PCR仪器扩增，扩增后将八联管芯片移至检测系统中，进行芯片的图像收集和目的核酸的绝对定量计算。

Clarity^TM digital PCR system

Clarity^TM 数字PCR芯片分区原理：Clarity数字PCR采用毛细管组成的芯片实现样本自动分区，主要借助毛细管虹吸原理实现分区，每个分区大小一致，分区结果稳定，数据重复性好。

Clarity^TM数字PCR优势

快速：96个反应完成时间<4h

准确：无交叉误差，结果更准确;

开放：与大部分PCR仪和试剂兼容;

可回收：简单震荡便可回收产物;

高通量：8h可完成近200个反应;

分区稳定：采用管中芯片技术，分区更稳定;

操作简单：无需专业人员操作;

参考文献：

1. Furuta-Hanawa, Birei, Teruhide Yamaguchi, and Eriko Uchida. "2D droplet digital PCR as a tool for titration and integrity evaluation of recombinant adeno-associated viral vectors." Human Gene Therapy ja (2019). PubMed PMID: 31140327. PubMed Central PMCID: PMC6707039.

2. Gobert, Guillaume, et al. "Droplet digital PCR improves absolute quantification of viable lactic acid bacteria in faecal samples." Journal of microbiological methods 148 (2018): 64-73. PubMed PMID: 29548643.

3. Lock, Martin, et al. "Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR." Human gene therapy methods 25.2 (2013): 115-125. PubMed PMID: 24328707. PubMed Central PMCID: PMC3991984.

4. Song, Neng, et al. "Detection of circulating Mycobacterium tuberculosis-specific DNA by droplet digital PCR for vaccine evaluation in challenged monkeys and TB diagnosis." Emerging microbes & infections 7.1 (2018): 1-9. PubMed PMID: 29691363. PubMed Central PMCID: PMC5915492.